PEG胁迫对柳叶水甘草种子萌发及幼苗的影响

岳 桦，李 雪

(东北林业大学园林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

大庆地处松嫩平原中部，地形平坦，土壤含盐量高，春季风大，干旱少雨，冬季寒冷干燥[1],由于常年干旱，加之土壤结构特性，大庆草原属于干旱生境，自然环境较差，能适应此生境的植物资源相对贫乏，因而，引种适宜生境的植物资源十分必要。

柳叶水甘草(Amsoniatabernaemontana)为夹竹桃科水甘草属多年生草本植物。水甘草属全世界约有30种，多分布于日本和中国的长江流域[2]，民间用作清热解毒药，治疗恶疮炎症等[3]。柳叶水甘草引自日本，植株高1 m，茎草绿色，花期较短，观叶、观果，是多年生、低维护性花卉。现已种植应用在沈阳及哈尔滨等地，是一种良好的观赏植物。目前，国内外对柳叶水甘草的研究多集中在化学成分提取及药理作用方面[3]，而生理方面的研究较少，关于干旱胁迫下的种子萌发和幼苗的抗旱性及生理响应研究仍处于空白阶段。种子萌发是植物生活史中的关键阶段，这一阶段发育的好坏，不仅影响种子本身的播种品质，而且还可能影响到种子下一代的生长发育[4]，因此，种子萌发期及幼苗期是进行抗旱性研究的重要时期。本研究以聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫的方法，分析比较不同干旱胁迫对柳叶水甘草种子萌发及幼苗的影响，评价其对干旱胁迫的适应能力与抗旱机理，从而为柳叶水甘草的引种驯化和园林应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1供试材料 供试材料柳叶水甘草种子采收于东北林业大学园林学院苗圃，采收后将种子置于常温下自然晾干，4 ℃冰箱中保存。2012年5月在东北林业大学园林学院进行试验。

1.2PEG干旱胁迫质量分数 采用不同质量分数的PEG溶液，形成不同的干旱条件。用分子量为6 000的PEG配制成不同质量分数的渗透溶液，设置5组质量分数，分别为5%、10%、15%、20%和25%，对应溶液水势梯度为-0.054、-0.177、-0.393、-0.735和-0.900 MPa[5]，蒸馏水作对照，每处理3次重复。

1.3种子萌发及幼苗PEG干旱胁迫处理方法 试验挑选优质、饱满种子，2%的次氯酸钠溶液处理大约10 min，蒸馏水冲洗干净。铺3层滤纸于90 mm的玻璃培养皿中，加入对应质量分数的PEG溶液吸湿滤纸，每皿放入30粒种子，置于30 ℃恒温、16 h光照的培养箱中。光强设置为5 000 lx，湿度66%。每两天更换一次滤纸。从种子置床之日起观察，以胚根露出种皮1～2 mm作为为萌发标志。 将试验各处理中最早有1 粒种子萌发之日作为该处理发芽的开始日期，每天定时记录萌发种子数，萌发末期连续3 d萌发粒数不足供试种子总数的1%时，记为萌发结束[6]。处理结束后，用蒸馏水洗净未萌发种子，进行恢复试验，进一步验证柳叶水甘草种子对干旱胁迫的恢复能力。

选择长势均匀一致的幼苗(苗高约5 cm)，移栽到锥形瓶中，添加50 mL的蒸馏水，并加适量的营养液，置于光照恒温培养箱中进行培养(30 ℃、全光)，育苗3 d后，分别将溶液置换为5%、10%、15%、20%、25%的PEG溶液，等量的蒸馏水作为对照，每6 h测定一次指标，连续测定5次，24 h后全部复水，进行恢复试验。

1.4相关指标测定

1.4.1种子萌发相关参数

1)萌发率(GR)=萌发种子数/供试种子总数×100%。

2)萌发速率系数(CGR)=[∑(t×n) /∑n]×100。

式中，t为自萌发试验开始时的天数；n为在t天内萌发的种子数[7]。

3)萌发指数(GI)=∑Gt/Dt。

4)活力指数(VI)=GI×S。

式中，Gt为第t天的发芽数，Dt为发芽天数，S为苗长。

1.4.2幼苗相关指标的测定 叶片电解质渗透率采用电导仪法测定[8]；叶片脯氨酸(Pro)含量采用磺基水杨酸提取，茚三酮显色法测定[9]；采用氮蓝四唑(NBT)还原法、愈创木酚法、硫代巴比妥酸(TBA)双组分光光度法测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化物酶(POD)[10]，在酶活性的测量中使用的主要仪器为UV-4802型双束紫外分光光度计和Z323K型高速冷冻离心机，每组5次平行。

1.5数据处理 数据统计应用SPSS 17.0软件，数据差异比较采用单因素方差分析和最小显著差异法，相关性评价采用Pearson相关系数法。Excel 2000作表。

2 结果与分析

2.1PEG干旱胁迫对柳叶水甘草种子萌发的影响 柳叶水甘草种子的萌发率为96.67%，随着PEG质量分数的增加，种子萌发率、萌发速率系数、萌发指数和活力指数均呈现小幅度上升再下降的趋势(表1)。

PEG质量分数达到20%(-0.735 MPa)时，萌发率为0。不仅各处理组与对照组的差异均达到显著水平(P<0.05)，而且各处理组之间的差异均达到极显著水平(P<0.01)。其中在低质量分数(5%)处理时，种子萌发率较对照组显著增高，说明PEG溶液对种子萌发起到了促进作用。15%PEG胁迫下种子萌发率仅19.43%，受到极显著的抑制作用。20%和25%PEG完全抑制了种子的萌发，同时各处理组均出现了程度不同、数量不等的种子腐烂现象，而对照组种子无腐烂现象发生或极轻微可忽略不计。以上结果说明，柳叶水甘草种子萌发阶段具有一定的耐干旱胁迫的能力。

PEG胁迫结束后，复水处理20%和25%PEG抑制不萌发的种子，发现恢复能力较强，仍能萌发(表2)。复水处理后20%和25%PEG胁迫种子萌发率高达91.57%和85.78%，萌发速率系数较大，5 d内萌发率已超过85%。而一些出现腐烂现象的种子萌发并没有受到影响，这可能与种子自身结构相关，具有种壳的种子内部并未受到影响。因此，柳叶水甘草种子在萌发前进行低质量分数的PEG胁迫处理，有利于提高其种子萌发率和萌发速率系数等各项指标，体现了柳叶水甘草种子的抗旱能力及抗旱品质。

表1 不同PEG质量分数对柳叶水甘草种子萌发的影响Table 1 Effects of different concentrations of PEG on the seed germination of Amsonia tabernaemontana

表2 不同PEG质量分数处理后复水对不萌发柳叶水甘草种子萌发的影响Table 2 Effects of water recovery on the nongerminated seeds of Amsonia tabernaemontana after different concentrations of PEG treatments

2.2PEG干旱胁迫对幼苗叶片相对电导率和丙二醛含量的影响 在轻度胁迫(5%)初期(6 h)，与对照组相比，叶片的MDA含量反而下降了(表3)，相对电导率在干旱下一直略有增加(表4)，而重度胁迫(≥15%)及胁迫末期，叶片MDA含量和相对电导率急剧升高，明显大于对照组，说明在轻度胁迫及干旱胁迫初期，柳叶水甘草叶片能够主动进行生理调节，降低膜脂过氧化程度，保护细胞膜结构，其抗旱能力增强。重度胁迫及胁迫末期，植物体内代谢开始紊乱，出现膜脂过氧化的现象，离子大量外渗导致MDA含量不断积累，抗旱能力下降。严重胁迫(20%、25%)下，复水都无法恢复到正常生命状态，说明质膜损害已经难以恢复，基本丧失抗旱能力。

2.3PEG干旱胁迫对幼苗叶片脯氨酸含量的影响 通过测量柳叶水甘草叶片游离脯氨酸的含量变化(表5)来研究叶片的渗透调节能力。在5个处理组模拟干旱环境下，脯氨酸含量表现出随时间的延长和程度的加深而逐渐升高的变化趋势，处理24 h后的5%、10%、15%、20%和25%处理下脯氨酸的含量分别为对照组含量的3.47、3.72、4.45、4.56和4.59倍。24 h后复水表明，轻度胁迫(5%、10%)下，脯氨酸含量逐渐降低；中度胁迫下(15%、20%)，含量虽有降低，但仍与对照组差异显著；重度胁迫(25%)下，脯氨酸含量持续下降，说明已经丧失了叶片渗透调节能力，25%PEG处理24 h已使幼苗处于致死状态。

表3 不同PEG质量分数对柳叶水甘草幼苗叶片的丙二醛含量的影响Table 3 Effects of different concentrations of PEG on MDA content of seedling leaves of Amsonia tabernaemontana %

表4 不同PEG质量分数对柳叶水甘草幼苗叶片的相对电导率含量的影响Table 4 Effects of different concentrations of PEG on relative electric conductivity of seedling leaves of Amsonia tabernaemontana %

表5 不同PEG质量分数干旱胁迫下柳叶水甘草幼苗叶片的脯氨酸含量Table 5 Proline contents in seedling leaves of Amsonia tabernaemontana under different concentrations of PEG treatments μg·g-1FM

2.4PEG干旱胁迫对幼苗叶片抗氧化酶系统的影响 SOD和POD为植物体内两种重要的抗氧化保护酶。随着胁迫程度的加深和胁迫时间的增加，柳叶水甘草叶片的两种酶活性呈现出先上升后下降的趋势(表6、表7)，说明低质量分数和短时间的干旱胁迫可促进柳叶水甘草叶片的抗氧化酶SOD和POD的活性；但高质量分数和长时间的PEG胁迫抑制抗氧化酶的活性，使得活性降低。

SOD活性在5%、10%胁迫下最大，12 h处理后分别为对照组的1.40和1.28倍，即轻度胁迫可激发SOD的活性；POD则在15%处理12 h时达到最大值，活性最强；在20%、25%胁迫条件下SOD和POD活性均下降。复水后各胁迫条件下，均有不同程度恢复。

2.5PEG干旱胁迫下幼苗叶片各生理生化指标的相关分析 干旱胁迫下柳叶水甘草叶片各生理生化指标的相关性见表8，相对电导率与丙MDA含量和脯氨酸含量呈极显著正相关(P<0.01)，与SOD活性呈极显著负相关；丙二醛与脯氨酸含量呈极显著正相关，与SOD和POD活性呈极显著负相关；SOD活性与POD活性呈显著正相关(P<0.05)。

表6 不同PEG质量分数干旱胁迫下柳叶水甘草幼苗叶片的SOD活性Table 6 Activities of SOD in seedling leaves of Amsonia tabernaemontana under different concentrations of PEG treatments

表7 不同PEG质量分数干旱胁迫下柳叶水甘草幼苗叶片的POD活性Table 7 Activities of POD in seedling leaves of Amsonia tabernaemontana under different concentrations of PEG treatments

表8 不同PEG质量分数干旱胁迫下柳叶水甘草幼苗叶片各生理生化指标的相关系数Table 8 Correlation coefficients of physiological and biochemical indexes in seedling leaves of Amsonia tabernaemontanaunder different concentrations of PEG treatments

3 讨论与结论

轻度胁迫(5%)时，种子萌发率提高，叶片相对电导率、MDA含量、脯氨酸含量、SOD和POD活性均有所提高，柳叶水甘草抗旱水平上升；中度胁迫(10%、15%)时，种子萌发率下降，叶片相对电导率、MDA含量、脯氨酸含量、SOD和POD活性出现浮动，但基本保持上升趋势，柳叶水甘草仍表现出一定的抗旱能力；重度胁迫(20%、25%)时，种子不萌发，叶片相对电导率、MDA含量、脯氨酸含量继续增加，SOD和POD活性均有所下降，基本丧失抗旱性。

PEG是一种渗透调节剂，在调节矿质元素、激素变化、蛋白质代谢和影响信号传导方面起着重要的作用[11]，其主要功能是减缓萌发初期水分进出种子的速率，可降低种子吸涨过程中膜系统的损伤且有利于受损膜系统的修复[12]。5% PEG胁迫可以提高柳叶水甘草种子的萌发率及活力指数等，超过这个阈值，各指标呈逐渐下降趋势。说明此质量分数的胁迫处于柳叶水甘草种子的耐受范围内，能够启动种子体内自身的一系列保护机制，减少吸胀过程中膜系统的损伤，有利于膜系统的修复，从而提高种子抗旱能力；当PEG质量分数继续增大时，超过了其耐受范围，种子萌发受到抑制。恢复试验进行复水后，仍具有较高的萌发率，可见膜系统并未受到损伤，只是暂时性抑制，种子仍具有萌发的能力。这个结论与焦树英等[13]的研究结果相一致。植物体内的游离脯氨酸含量在一定程度上反映了植株体内的水分状况，因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标[14],但是脯氨酸与植物的抗旱性之间的关系仍存在争议。有研究[15-16]认为，干旱胁迫下脯氨酸积累量与抗旱性呈正相关；也有研究[17]认为，脯氨酸的积累属于干旱胁迫产生的结果，因为有些植物在逆境条件下脯氨酸含量变化不大。本研究中，干旱胁迫下的幼苗叶片中脯氨酸含量显著增加，也与相对电导率及MDA含量呈极显著正相关，在胁迫后期显著增加，说明脯氨酸积累对干旱胁迫有相关反应，本研究认为，将叶片中的游离脯氨酸含量变化看作干旱胁迫下的生理响应比较合理，此结论与卢少云等[17]研究结果一致。在植物遭遇到环境胁迫时，植物体内的保护酶系统开始发挥作用以此进行自我防御。在胁迫试验中，酶活性一般随胁迫加深而增加，或者呈先增加后降低的基本态势[18]。本研究表明，柳叶水甘草SOD和POD活性先升后降，在低质量分数和短时间的PEG胁迫范围内，植株体内通过自身增加酶的活性来调节平衡，使其适应干旱胁迫能力增强。如果干旱胁迫超过一定的耐受范围，其保护酶的活性会逐渐减弱，柳叶水甘草的耐干旱能力随之减弱，表明柳叶水甘草对干旱胁迫的忍耐有一定局限性。SOD在胁迫初期，表现最活跃，启动了自身防御系统，在一定程度上调节了自身的平衡；随着胁迫程度的加深，植物体内的代谢开始出现紊乱，SOD活性也大幅下降。POD活性的高峰则出现在SOD开始下降时期，原因可能是因为SOD产生的大量H2O2，作为清除H2O2的活性酶过氧化物酶开始大量产生并且表达，说明这两种酶表现为相互协调的作用，呈现显著正相关性。

从幼苗生理生化指标相关性分析中可以看出，PEG模拟干旱胁迫下柳叶水甘草相对电导率与SOD活性呈极显著负相关；MDA含量与SOD和POD活性呈极显著负相关，说明在干旱胁迫下，幼苗自身生理调节功能失衡，出现膜脂过氧化的现象，离子大量外渗导致MDA含量不断积累，又反作用于抗氧化酶，抑制酶活性，减弱酶系统的基本功能。如此多重作用于植株，最终干旱胁迫致死。

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