NNK和B[a]P在卷烟烟气复杂基质中的联合遗传毒性

木潆，朱茂祥，潘秀颉，杨陟华，齐绍武

1 湖南农业大学 烟草工程技术研究中心，长沙410128；2 军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850

近年来，卷烟安全性问题受到日益显著的重视。卷烟烟气是由数千种化合物组成的一种混合物[1]。卷烟烟气具细胞毒性、遗传毒性及诱变性，这些化合物之间的相互作用会影响单一物质对卷烟烟气毒性的贡献。谢剑平等[2]研究发现：在卷烟烟气众多有害成分中，对卷烟主流烟气危害性影响最大的7项有害成分指标为∶ CO、HCN、NH3、甲基亚硝胺吡啶基丁酮（NNK）、苯并[a]芘（B[a]P）、苯酚、巴豆醛。当前常规卷烟安全性评价的方法最常用的是对焦油、一氧化碳和烟气烟碱三项指标的评价[3],很少涉及到卷烟烟气有害物之间的相互作用关系、烟气吸入后对人体的毒性作用及其作用机制等问题的研究, 这显然是不全面的。相关研究表明[4-9]，卷烟烟气和烟气冷凝物均可以导致细胞微核的出现。卷烟烟气冷凝物可以导致培养的哺乳动物细胞出现染色体畸变[10-14]。微核试验作为推断化合物染色体损伤的遗传毒性检测方法，具有快速、简便、经济等特点，在环境化合物快速筛选和大量职业暴露人群检测方面得到广泛应用。微核检测的敏感性、特异性和准确性优于其它染色体畸变分析，因此许多国家和国际组织将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理学安全性评价的必做实验[15]。微核检测方法主要集中于镜检法（常规微核试验、胞质分裂阻滞法、荧光原位杂交试验与DNA 探针、抗着丝粒抗体染色）和自动化法（图像分析系统检测和流式细胞仪检测）[16]。

B[a]P、NNK为两种卷烟烟气重要代表有害物，具一定的致癌性[17-18]，已成为近年来有关烟草致癌研究的热点，卷烟主流烟气化学成分中B[a]P、NNK的含量情况如下表1所示[2]。笔者以肯塔基参比卷烟3R4F为研究对象，以B[a]P、NNK为目标化合物，采用广泛应用于细胞诱变性试验的镜检微核法[19]，结合三者对人体支气管上皮细胞的毒性作用，分析B[a]P、NNK在卷烟烟气复杂基质中的联合作用，以期为卷烟烟气的安全性评价提供参考。

表1 163种不同类型卷烟样品中NNK和B[a]P成分比较[2]

1 材料与方法

1.1 材料

肯塔基参比卷烟3R4F(美国肯塔基大学)；LHC-8培养液( Biofluids Inc公司)；胰蛋白酶、B[a]P (纯度≥96%，Sigma公司)；NNK (纯度≥99.0%，Alfar Aesar公司)；细胞松弛素B(Applichem公司)；DAPI(罗氏试剂)；甲醇溶液；洁净工作台(北京冠鹏净化设备有限公司)；TS100倒置显微镜(Nikon公司 )；BB15型 CO2孵 箱 (Thermo公 司 )；Milli-Q50超纯水仪(Millipore公司)；JJ100型单通道吸烟机（中国烟草总公司郑州烟草研究院）。

1.2 细胞培养

腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支气管上皮细胞（BEAS-2B），用无血清的LHC-8培养基，在37℃、5% CO2和95%湿度条件下培养箱中培养[19]。

1.3 卷烟烟气凝聚物（CSC）的制备

设定抽烟机抽吸周期为 60 s、抽吸长度为 2 s，抽吸容量为 30 mL。连接密封的两个玻璃气体采样收集器，第一个收集器内装有 5.0 mL 95%的乙醇，另一个收集器内装有 5.0 mL 双蒸水，用打火机点燃卷烟样品，将燃烧产生的烟气通过橡皮导管通入气体收集管，依照早已设定的抽吸速率，连续不停地收集10 支卷烟抽吸产生的烟气于收集器内。等最后一支抽吸完后，将两个收集器中的液体充分混匀，定容至10.0 mL 容量瓶中摇匀，分装在 0.5 mL EP管中用封口膜封口，后放入液氮罐中储藏备用。卷烟烟气冷凝物CSC的浓度为10mg/mL[20]。

1.4 实验方法

1.4.1 微核试验方法

笔者先采用细胞毒性测试检测出三种受试物的IC50[20]。收集处于指数生长期的BEAS-2B细胞，制成细胞悬液（1.4×105个/mL），接种于35×10mm小皿（2mL/皿），在相对湿度95%、5%CO2、37℃下培养24 h后按剂量染毒，设置空白对照组、处理组（1/10 IC50、1/5 IC50、IC50三个浓度）、阳性对照组，每组设三个平行试验。取一定体积的细胞培养液（内含2.8×105个细胞），于离心涂片机（500rpm，5min，低加速度）进行涂片，将上述玻片浸入100%甲醇（10min），于黑暗环境中放置直至染色，固定后的玻片浸入DAPI液（10min），然后于400X荧光显微镜下进行微核计数。每一组培养液分析2000个单核细胞（非凋亡或死亡）的细胞微核数，每组培养液重复两次（等于4000个细胞）计算微核率。（微核观察需注意一下条件：微核为近圆形，同细胞主核染色近乎相同，Size≤1/3细胞主核，微核与主核接触但并不与之重叠）[21]。

1.4.2 联合作用细胞毒性的测定与分析

采用线性回归分析CSC、B[a]P、NNK三者之间的联合作用。即计算出三种受试物（三个剂量）分别诱发细胞微核率后，选择各个受试物低剂量（1/10IC50），再与另外两种受试物混合后作用BEAS-2B细胞。根据联合染毒诱发的细胞微核率，计算出CSC、B[a]P、NNK两两作用和三者联合作用的预期值[22]，并与实际值相比较。实际值小于预期值，表明受试物之间为协同作用；实际值大于预期值，表明受试物之间为拮抗作用；实际值与预期值接近，表明受试物之间无明显协同作用。

2 结果与分析

2.1 单独作用遗传毒性试验结果

由表2可知， CSC、NNK和B[a]P均可诱发细胞微核率增高，并有较好的剂量效应关系。相同细胞存活剂量条件下，诱发细胞微核形成能力比较：B[a]P＞NNK＞CSC。

表2 CSC、NNK、B[a]P单独作用诱发BEAS-2B细胞微核率

2.2 联合作用遗传毒性

2.2.1 B[a]P与CSC联合作用诱发细胞微核率

由图1可知，固定低剂量B[a]P（1/10 IC50）与不同浓度CSC联合作用，固定低剂量CSC（1/10 IC50）与不同浓度B[a]P联合作用，随着剂量的增加，细胞微核率均呈现上升趋势，表现剂量依赖趋势。诱发细胞微核率均显著低于预期值，并与作用的先后顺序无关，特别是在较低剂量是与单纯作用结果相当，提示两者联合作用诱发细胞微核存在一定的拮抗效应。诱发细胞微核能力比较∶ B[a]P+CSC ＞ CSC+ B[a]P。

2.2.2 CSC与NNK联合作用诱发细胞微核率

由图2可知，固定低剂量CSC（1/10 IC50）与不同浓度NNK联合作用，固定低剂量NNK（1/10IC50）与不同浓度CSC联合作用，随着剂量的增加，细胞微核率均呈现上升趋势，表现剂量依赖趋势。诱发细胞微核率明显低于预期值，并与作用的先后顺序无关，特别是在较低剂量是与单纯作用结果相当，提示两者联合作用诱发细胞微核存在一定的拮抗效应。诱发细胞微核能力比较∶NNK+CSC ＞ CSC+NNK。

图1 B[a]P与CSC联合作用对BEAS-2B细胞微核率的影响

图2 CSC与NNK联合作用对BEAS-2B细胞微核率的影响

2.2.3 B[a]P与NNK联合作用诱发细胞微核率

由图3可知，固定低剂量B[a]P（1/10 IC50）与不同浓度NNK联合作用，固定低剂量NNK（1/10 IC50）与不同浓度B[a]P联合作用，随着剂量的增加，细胞微核率均呈现上升趋势，表现剂量依赖趋势。诱发细胞微核率显著低于预期值，特别是在较低剂量是与单纯作用结果相当，提示两者联合作用诱发细胞微核存在一定的拮抗效应。诱发细胞微核能力比较∶NNK+B[a]P ＞ B[a]P+ NNK。

图3 B[a]P与NNK联合作用对BEAS-2B细胞微核率的影响

2.2.4 CSC、B[a]P与NNK三者联合作用诱发细胞微核率

由图4可知，三者联合作用随着剂量的增加，细胞微核率均呈现上升趋势，表现剂量依赖趋势。诱发细胞微核率显著低于理论预期值2，但与理论预期值1的结果相差较小。特别是固定低剂量B[a]P（1/10 IC50）和固定低剂量NNK（1/10 IC50）存在时，再加入CSC诱发的细胞微核率接近理论预期值1，提示有较弱的相互作用（弱相加）。诱发细胞微核能力 比 较 ∶ (B[a]P+NNK)+CSC ＞ (CSC+B[a]P)+NNK ＞(NNK+CSC)+B[a]P。

图4 CSC、B[a]P与NNK三者联合作用对BEAS-2B细胞微核率的影响

3 讨论

相关研究[23-24]表明，支气管上皮细胞为吸入式有害物质在体内代谢活化的主要场所。本实验所用BEAS-2B细胞，是由正常人支气管上皮细胞经腺病毒-12/SV40杂交病毒感染，连续传代筛选而永生化所得，是研究肺癌相关机理的重要靶细胞。B[a]P可导致肺癌A549细胞DNA损伤，使细胞周期发生阻滞[25]；B[a]P与多氯联苯联合作用时，能抑制B[a]P代谢产物葡萄糖化，减缓B[a]P代谢速率[26]；2, 4,6 - 三硝基甲苯(TNT)与B[a]P呈拮抗效应，可阻止B[a]P进入细胞[27]。NNK在烟草中含量高，能造成细胞的氧化损伤[28]，诱导支气管上皮细胞的恶性转化[29], 与肺癌的相关性很高[30]。α粒子和NNK联合作用于BEP-2D细胞时，协同效应显著[31]，而B[a]P和NNK之间的联合作用却少见文献报道。探究B[a]P、NNK在卷烟烟气复杂基质中的相互作用关系，有利于分析卷烟烟气有害物质的毒性作用及相关机理，构建符合其特征性的危害性研究方法。

本试验以BEAS-2B为靶细胞，通过对CSC及其最具代表性的有害成分NNK和B[a]P的联合作用诱发细胞微核能力进行分析，发现B[a]P、NNK与CSC均具有体外细胞诱变性，且存在明显剂量效应关系。B[a]P与CSC的联合作用、B[a]P与NNK的联合作用、CSC与NNK的联合作用均具有剂量依赖效应，但比预期毒性小，并与作用的先后顺序无关。特别是在较低剂量是与单纯作用结果相当，提示两两联合作用诱发细胞微核存在一定的拮抗效应。三者联合作用时均具明显的剂量效应关系，诱发细胞微核率显著低于理论预期值2，但与理论预期值1的结果相差较小。特别是固定低剂量B[a]P（1/10 IC50）和固定低剂量NNK（1/10 IC50）存在时，再加入CSC诱发的细胞微核率接近理论预期值1，提示有较弱的相互作用（弱相加）。笔者推测B[a]P和NNK可能与卷烟烟气中其他成分发生协同作用作用，随着CSC含量的上升，激活了BEAS-2B细胞CSC中其他物质代谢的相关酶类物质，促使CSC代谢加快，表现为诱发微核率上升趋势较快，增大了细胞的遗传毒性。

4 小结

本研究证实B[a]P、NNK与CSC之间两两联合存在拮抗作用，而三者之间的联合作用呈现协同（弱相加）效应。这一结果，对评价卷烟烟气中有害成分的危害性具有一定的指导意义。同时也提示卷烟烟气中其他有害成分（如苯酚、巴豆醛、重金属等）物质之间的相关性，有待进一步研究。

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