Bmal1在胃癌组织中的表达及其临床意义

魏 柏，熊枝繁，陈景三

华中科技大学同济医学院附属梨园医院1．肿瘤内科;2．消化内科，湖北武汉430077

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，它的发生、发展是多因素、多步骤的复杂生物学过程。如何通过分子生物学手段达到改善胃癌疗效已成为目前研究的主要方向。钟基因是调节生物体周期性变化的物质基础［1-2］，近年来钟基因和肿瘤的相关性逐渐引起学者们的重视。Bmal1作为生物钟的重要调节因子之一，参与协调组织细胞的增殖、凋亡及生长代谢的节律性，在乳腺癌、脑神经胶质瘤等实体瘤中都有所表达，但在胃癌中的作用机制目前还不明确。本研究中我们采用免疫组化的方法检测胃癌组织中Bmal1的表达情况，并探讨其表达与胃癌临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1．1 组织标本 15例胃癌手术切除标本取自华中科技大学同济医学院附属梨园医院，取材后30 min内投入液氮中速冻，后放入－80℃冰箱保存，用于Bmal1 mRNA表达检测;另收集梨园医院2005年－2008年病理科归档的原发性胃癌标本64例及其配对癌旁组织(距离肿瘤边缘5 cm以上组织，经病理检查证实为非癌组织)蜡块，男41例，女23例，年龄32～78岁，平均(51．3±5．4)岁。根据UICC分期:T1～T2期23例，T3～T4期41例;根据其分化程度分为:高－中分化48例，低分化16例。

1．2 主要试剂 Trizol购自Invitrogen公司;兔抗人Bmal1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1．3 real time RT-PCR检测 引物由上海生工合成，Bmal1(NM-001178)上游引物:5'-GTACCAACATGCAACGCAATG-3';下游引物:5'-TGTGTATGGATTGGTGGCACC-3';β-actin(NM-001101)上游引物:5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3';下游引物:5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。第一步提取上述组织的总RNA，逆转录成cDNA;第二步做定量PCR，95℃10 min;接着95℃15 s;62℃60 s，重复40个循环;同时以β-actin作为内参，定量PCR的结果采用比较法测定目的基因的相对表达(即目的基因量=2△△Ct)，分析胃癌组织及癌旁组织Bmal1 mRNA的表达差异。

1．4 免疫组化染色和判断标准 将标本石蜡块连续切片，贴于已处理过的载玻片上，置于烤片机上烘干以便进行免疫组化染色。兔抗人Bmal1购自Santa Cruze公司，抗体稀释比例为1∶50。

1．5 免疫组化结果判定 着色部位为胞浆和/或胞核，出现棕黄色或褐色颗粒为阳性细胞。免疫组化半定量分组的标准:根据染色程度和染色细胞所占百分比进行评分。染色程度:基本不着色为0级，淡黄色为1级，黄色为2级，棕褐色为3级。染色阳性细胞百分比计数:着色阳性细胞占计数细胞＜5%为0级，5%～25%为1级，25%～50%为2级，50%～75%为3级，＞75%为4级，将染色程度分级与染色细胞百分比相乘，乘积＞4级为高表达，0～3为低表达;同时采用同济千屏影像公司HPIAS2000型图像分析软件，光学显微镜下每张片取6个高倍镜下视野，输入图像分析系统，计算阳性细胞的吸光度值以判断蛋白表达强弱。

1．6 统计学方法 采用SPSS 13．0进行统计学分析。数据以±s表示，组间吸光度值的比较采用t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 Bmal1 mRNA在胃癌及癌旁组织中的表达Bmal1 mRNA的扩增曲线呈典型的S型，熔解曲线为单峰，排除非特异性的扩增及引物二聚体的出现。实时荧光定量PCR对15例胃癌及癌旁组织中Bmal1 mRNA相对转录量的检测结果显示，胃癌和癌旁组织中均有Bmal1 mRNA转录，胃癌组织中Bmal1 mRNA转录量为1．02±0．05，癌旁组织中为0．57±0．03，Bmal1 mRNA在胃癌中的转录量高于癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0．05)。

2．2 Bmal1蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达 免疫组化结果及图像分析软件显示，胃癌及癌旁组织中Bmal1均有表达，但Bmal1蛋白表达部位及表达量差异有统计学意义。64例胃癌组织在细胞胞浆中可见Bmal1高表达，部分细胞胞核也可见Bmal1表达，细胞DAB染色棕色颗粒多，颜色深(见图1～3);而相配对的癌旁组织中，棕色颗粒多聚集在细胞核且染色浅，为Bmal1低表达(见图4)。

图1 Bmal1在低分化胃癌中的表达;图2 Bmal1在中－低分化胃癌中的表达;图3 Bmal1在高分化胃癌组织中的表达;图4 Bmal1在癌旁组织中的表达(HE染色200×)Fig 1 Imm unohistochem ical stain of the Bmal1 p rotein in poorly differentiated gastric cancer;Fig 2 Immunohistochem ical stain of the Bmal1 protein in moderately-poorly differentiated gastric cancer;Fig 3 Immunohistochem ical stain of the Bmal1 protein in well-differentiated gastric cancer;Fig 4 Immunohistochem ical stain of the Bmal1 protein in adjacent tissue of gastric cancer (Orininal magnification 200×)

2．3 Bmal1的蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系

Bmal1表达的平均吸光度值与胃癌患者性别、肿瘤大小、浸润深度、有无淋巴结转移等均无关，与年龄、分化程度呈正相关(见表1)。

2．4 Bmal1 mRNA和Bmal1蛋白表达的关系 胃癌组织中Bmal1 mRNA转录量为1．02+0．05和Bmal1蛋白吸光度值为0．1816±0．0128，均高于癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0．05)，mRNA与蛋白水平表达一致。

3 讨论

本研究利用敏感性强、特异性高的实时荧光定量PCR法检测发现，Bmal1 mRNA在胃癌组织及癌旁组织中均有表达，且胃癌组织中的转录量高于癌旁组织，可见Bmal1 mRNA的过表达可能参与胃癌的发生、发展过程。但本研究用于实时荧光定量PCR病例数较少，影响统计结果的准确性，因此需要更多病例样本分析Bmal1 mRNA表达水平和肿瘤临床病理特征各参数如肿瘤的大小、分级、转移等的相关性。

表1 Bmal1的蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系(±s)Tab1 The relationship between the expression of Bmal1 protein and clinicopathologic characteristics of gastric cancer

表1 Bmal1的蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系(±s)Tab1 The relationship between the expression of Bmal1 protein and clinicopathologic characteristics of gastric cancer

临床病理特征 例数 Bmal1平均吸光度值P 22 0．2295±0．0210 64 0．1816±0．0128 0．03癌旁组织 64 0．1041±0．0543性别0．793男41 0．1668±0．0208女23 0．1454±0．0334年龄(岁) 0．04≥60 35 0．2216±0．0128＜60 29 0．1541±0．0543肿瘤大小(cm) 0．122≥3．5 22 0．1530±0．0300＜3．5 42 0．1662±0．0424分化程度0．001高－中分化 44 0．1488±0．0485低分化 20 0．2626±0．0125浸润深度0．06 T1～T2 23 0．1579±0．0500 T3～T4 41 0．2125±0．0109淋巴结转移0．06阴性 42 0．1692±0．0386阳性癌组织

既往研究已证实Bmal1在某些实体瘤中确有表达。本实验则通过免疫组化方法证实Bmal1蛋白在胃这一外周器官中确实有表达，可见作为生物钟体系的起始因子使胃组织和细胞水平的生命活动高度有序［3-4］，这与此前研究发现Bmal1以Clock-Bmal1异二聚体的形式选择性与E-box结合，从而激活钟基因体系中其他基因转录的结论是一致的，由此推测胃作为一外周效应器官，其生物节律除受到中枢生物钟控制下的各种神经、体液及其他信号分子直接或间接地调控外，自身也有一定生物节律性;免疫组化结果还提示在胃癌癌旁组织中Bmal1主要表达在胞核且表达弱，在胃癌组织的胞浆中有强表达，推测可能与Bmal1在胃癌细胞胞浆中无法正常泛素化降解，在胞浆中持续积聚，最终导致胞浆内 Bmal1高表达［5-6］有关，同时Per2蛋白的降低可促进Bmal1的表达，Per与Cry蛋白复合体又促使Bmal1蛋白从异二聚体中解聚从而更易被降解［7］;也就是说Bmal1表达部位差异与胃癌发生、发展过程中Clock/Bmal1环路异常激活导致钟基因表达紊乱相关。

此外本研究结合免疫组织化学方法和图像分析技术对Bmal1阳性细胞进行平均吸光度值测试，结果表明Bmal1在胃癌组织的平均吸光度值高于癌旁组织，差异具有统计学意义，可见在胃癌组织中表现出的生物钟基因与癌旁组织缺乏同步性，提示多方面因素如进食、激素、细胞因子等可诱导生物节律钟基因重置并显示出一定的独立性，推测Bmal1可能与胃癌的发生、发展有一定程度的相关性，这与此前学者的报道相符［8］。本研究还证实Bmal1与患者性别、肿瘤大小、浸润深度、有无淋巴结转移等均无关，与年龄、分化程度呈正相关，推测与Bmal1参与细胞分化增殖、凋亡及生长过程相关，其机制还有待进一步研究。

本研究分析提示Bmal1 mRNA和蛋白两个水平在胃癌组织中的表达均高于癌旁组织，从而在mRNA和蛋白水平同时证明了Bmal1可能参与了胃癌的发生、发展过程，其高表达可导致细胞增殖和凋亡的周期变化。考虑到肿瘤生物学行为很复杂，并且生物节律调控机制具有多样性，因此单用Bmal1表达难以完全解释，另一方面考虑样本量也可对此造成影响，同时本研究属于回顾性研究，标本的变异和患者的选择偏倚都可能造成假阴性的结果。因此，Bmal1作为生物节律基因是否可作为预后不良的生物学指标目前尚无明确结论。

综上所述，Bmal1的异常表达与胃癌的发生、发展相关，Bmal1有望成为胃癌诊断和预后判断的辅助指标。在进一步试验中我们将探索胃癌中生物钟基因及蛋白产物如何改变及相互影响最终导致胃癌的发生、发展的机制。

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