p-mTOR、p-p70S6K蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达

陈业刚，杨 拓，刘 鹏，王建民，孙 光

p-mTOR、p-p70S6K蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达

陈业刚1，杨 拓1，刘 鹏1，王建民1，孙 光2

目的：探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路蛋白（p-mTOR）、核糖体蛋白S6激酶（p-p70S6K）在膀胱尿路上皮癌中的表达情况及与预后的关系。方法：利用免疫组化染色检测mTOR通路蛋白p-mTOR、p-p70S6K在膀胱尿路上皮癌中的表达情况，分析p-mTOR、p-p70S6K在不同膀胱组织中的表达差异，与膀胱癌临床病理参数的关系及与膀胱尿路上皮癌预后的关系。结果：p-mTOR在膀胱尿路上皮癌中的阳性表达率（43.3%）高于正常黏膜（17.5%），p-mTOR表达阳性率随着肿瘤分级分期的增加相应增加，多发性膀胱尿路上皮癌p-mTOR表达阳性率（70.5%）高于单发组（31.4%），复发组（70.5%）高于未复发组（31.4%，P＜0.01）；p-p70S6K在膀胱尿路上皮癌阳性率（25.9%）高于正常膀胱黏膜（7.5%，P＜0.05），p-p70S6K表达阳性率随着肿瘤分级分期的增加相应增加，多发性膀胱尿路上皮癌p-p70S6K表达阳性率（45.9%）高于单发组（17.1%），复发组（30.3%）高于未复发组（17.4%，P＜0.01）；肿瘤分级、分期、数目及p-mTOR表达分别是膀胱肿瘤无瘤生存的独立预后因子。结论：mTOR/p-mTOR/p-p70S6K通路的激活与膀胱尿路上皮癌的发生发展有关，p-mTOR可以作为预测膀胱尿路上皮癌复发的预后因子。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；核糖体蛋白S6激酶；膀胱尿路上皮癌；蛋白表达

PI3K/Akt/mTOR信号转导通路在肿瘤的形成和发展中扮演非常重要的角色,并参与肿瘤的侵袭和转移。本实验通过研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路蛋白p-mTOR、核糖体蛋白S6激酶（p-p70S6K）在膀胱尿路上皮癌中的表达情况，探讨p-mTOR、p-p70S6K在肿瘤发生发展中的作用，并且为mTOR抑制剂应用于膀胱尿路上皮癌的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2006年1月—2009年1月天津医科大学第二医院泌尿外科术后病理确诊为膀胱尿路上皮癌的病例，排除随访资料不完整、姑息手术或者二次手术的患者，随机选取201例，肿瘤分期采用膀胱癌2009年TNM分期系统，分级同时采用WHO 1973分级法WHO 2004年分级法。患者平均年龄65岁（25～89岁）；男137例，女64例；分期：pT1期94例（46.8%），pT2期46例（22.9%），pT3期37例（18.4%），pT4期24例（11.9%）；分级：G1～2级127例（63.2%），G3级74例（36.8%）。随访时间35个月（3～45个月），复发81例（40.3%），复发时间8个月（1～24个月）。临床资料见表1。同时选取40例正常膀胱黏膜组织作为对照。

表1 p-mTOR、p-p70S6K与膀胱尿路上皮癌临床病理参数的关系（n,%，n=201)

1.2 方法 免疫组化染色检测p-mTOR、p-p70S6K在膀胱尿路上皮癌中的表达。PV-9001兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒、浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物公司；抗phospho-mTOR(Ser2448, 49F9)、phosphor-p70S6 kinase(Thr389;1A5)购自Cell Signaling Technology(Beverly,MA,USA)。

石蜡切片常规脱水脱蜡水化，0.01M、pH6.0枸橼酸缓冲液高温高压修复抗原，DAB显色。苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。对照组用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知的阳性乳腺癌组织作为阳性对照。以肿瘤细胞胞浆、胞核或胞膜上出现棕黄色为阳性。每张切片随机选取10个高倍视野(×400)，计算这10个高倍视野阳性细胞的平均百分比。根据着色强度和着色细胞百分率判断结果。染色强度：未着色为0分，淡黄色为1分，黄色或黄褐色为2分，褐色为3分。着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，≥50%为3分。将着色程度和着色百分率得分乘积，结果0～5分为低表达，6～9分为高表达[1]。

1.3 统计方法 采用SPSS 15.0 for Windows统计软件，运用单因素方差分析、χ2检验和Cox回归模型进行统计分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 p-mTOR、p-p70S6K在膀胱尿路上皮癌和正常膀胱黏膜的表达 p-mTOR主要表达于胞浆，p-p70S6K主要表达于胞核（图1）。40例正常膀胱黏膜组织中，p-mTOR阳性7例，占17.5%，p-p70S6K阳性3例，占7.5%；201例膀胱尿路上皮癌组织中，p-mTOR阳性87例，占43.3%，p-p70S6K阳性52例，占25.9%。p-mTOR、p-p70S6K在膀胱尿路上皮癌中的表达明显高于正常膀胱黏膜（P＜0.05）。详见表2。

图1 p-mTOR、p-p70S6K在不同膀胱黏膜中的表达（×200）

表2 p-mTOR和p-p70S6K在膀胱上皮中的表达（n,%）

2.2 p-mTOR、p-p70S6K表达与膀胱尿路上皮癌临床病理参数的关系 p-mTOR与肿瘤分级、分期、是否多发相关。随着肿瘤分级分期的增加，p-mTOR表达阳性率相应增加；多发性膀胱尿路上皮癌p-mTOR表达阳性率(70.5%)高于单发组(31.4%)；复发组（70.5%）高于未复发组（31.4%），差异有统计学意义（P＜0.01）；p-mTOR表达与年龄、性别、肿瘤分期差异无统计学意义。

p-p70S6K与肿瘤分级、分期、是否多发相关。随着肿瘤分级分期的增加，p-p70S6K表达阳性率相应增加；多发性膀胱尿路上皮癌p-p70S6K表达阳性率（45.9%）高于单发组（17.1%）；复发组（30.3%）高于未复发组（17.4%）差异有统计学意义（P＜0.01）；p-mTOR表达与年龄、性别差异无统计学意义。详见表1。

2.3 p-mTOR、p-p70S6K表达与膀胱尿路上皮癌预后分析 单因素分析结果显示肿瘤分级、分期、数目及p-mTOR、p-p70S6K表达均与肿瘤无瘤生存具有相关性；单因素分析中所得出的对膀胱尿路上皮癌预后有影响的因素用Cox回归模型进行多因素分析，结果显示，肿瘤分级、分期、数目及p-mTOR表达分别是膀胱肿瘤无瘤生存的预后因子，p-p70S6K表达在单因素分析中与预后相关，在最终的多因素模型中却未能显示其有统计学意义。详见表3、表4。

表3 膀胱尿路上皮癌无瘤生存率的单因素分析(n=201)

表4 膀胱尿路上皮癌无瘤生存率的多因素分析(n=201)

3 讨论

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白是雷帕霉素的靶分子，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。mTOR通过调节细胞周期、蛋白质合成、细胞能量代谢、血管生成等多种途径，控制细胞增殖、生长、分化[2]。mTOR上游通过PI3K/AKT通路或PI3K/AKT/TSC2通路被激活，激活后的mTOR可调节核糖体S6蛋白激酶（S6K）和真核细胞始动因子4E结合蛋白1（4EBP1）的合成，它们是蛋白翻译的关键调节因子，分别控制特定亚组mRNA的翻译[3]。

Puzio-Kuter等[4]报道，肿瘤抑制基因p53和pten的失活，能够促进膀胱肿瘤向浸润性发展，与膀胱肿瘤的预后相关，而其作用机制正是通过激活mTOR信号通路实现的。因此，我们推测，mTOR通路是膀胱肿瘤发生发展过程中的重要通路。

p-mTOR、p-p70S6K与肿瘤发生有关，p-mTOR、p-p70S6K在膀胱肿瘤中的表达较正常组织明显增加。已知的研究表明，p-mTOR、p-p70S6K促进蛋白的合成，表明mTOR/p70S6K的激活使膀胱上皮生长活跃，与膀胱肿瘤的发生有关，目前在膀胱肿瘤中尚无相关研究。Dai等[5]用免疫组化法检测了前列腺组织中p-mTOR相关蛋白的表达情况，在癌前病变HGPIN阶段，p-mTOR通路蛋白表达高于正常前列腺癌组织，而低于前列腺癌，表明p-mTOR促进前列腺癌的发生。

我们分析了p-mTOR、p-p70S6K与年龄、性别、肿瘤分期、分级的关系。结果表明，p-mTOR、p-p70S6K与患者年龄、性别无关（P＞0.05），而与膀胱癌的分期、分级及肿瘤是否多发相关。在类似的研究中，Hansel等[6]检测了121例浸润性膀胱癌p-mTOR、p-70S6K的表达情况，p-mTOR、p-70S6K在低分级分期膀胱肿瘤中表达，表明是膀胱肿瘤发生的早期时间；在高分级分期肿瘤中，p-mTOR表达增高，与肿瘤病理分期、预后相关。表明p-mTOR的激活会导致肿瘤侵袭性的增加，研究结论与本文一致。这在许多其他肿瘤研究中有相似的结论，如宫颈癌、胃癌、肾癌。同时，我们发现，二者与肿瘤是否多发存在相关性，表明p-mTOR/p-70S6K通路的激活导致膀胱上皮细胞增生活跃，易导致肿瘤细胞多发。

我们还分析了膀胱肿瘤预后的预后因素，p-mTOR与肿瘤的病理分期、分级一样，是肿瘤的独立预后因子，p-mTOR表达增加的患者预后差，尤其表现在肿瘤复发率高于正常表达者。由于研究对象的随访时间较短，死亡率不高，我们未分析二者与死亡率的差异。但是Hansel等[6]补充了这一不足，他们的研究结果表明，p-mTOR与淋巴结转移和肿瘤预后相关。类似的研究结果在胆管癌、乳腺癌、宫颈癌、胃癌中都有报道[7-8]。

mTOR/p70S6K通路的激活会引起膀胱上皮增生活跃，导致膀胱肿瘤发生、浸润、转移，p-mTOR是膀胱癌复发的独立预后因素。对mTOR通路在膀胱尿路上皮癌中的研究，有助于阐明膀胱癌发病机制，并为以mTOR为靶点的抑制剂用于治疗膀胱肿瘤提供依据。

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（收稿：2013-03-22 修回：2013-08-26）

（责任编辑 张亚强）

Expression of p-mTOR and p-p70S6K in Urothelial Bladder Cancer

CHEN Ye-gang,YANG Tuo,LIU Peng,et al Department of Urology,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

ObjectiveTo investigate the expression of p-mTOR and p-p70S6K in human bladder cancer tissues and the correlation with the prognosis.MethodsThe expression of p-mTOR and p-p70S6K was de⁃tected in normal bladder tissues and bladder cancer tissues by immunohistochemistry.Their relationship with clinicopathological characteristics and prognosis was analysed by Kaplan-Meier method and Log rank test.ResultsThe expression of p-mTOR in bladder cancer tissues was 43.3%,higher than 17.5%in normal blad⁃der tussues.The positive rate of p-mTOR expression increased with the progress of pathological stage and tumor grade.The expression of p-mTOR was 70.5%in multiple bladder tumors,higher than 31.4%in single bladder tumor;70.5%with positive expression of p-mTOR relapsed,higher than 31.4%without recurrence.The expres⁃sion of p-p70S6K in bladder cancer tissues was 25.9%,higher than 7.5%in normal bladder tussues.The posi⁃tive rate of p-p70S6K expression increased with the progress of pathological staging and tumor grade.The ex⁃pression of p-p70S6K was 45.9%in multiple bladder tumors than 17.1%in single bladder tumor;30.3%with positive expression of p-p70S6K relapsed,higher than 17.4%without recurrence.The difference was statistical significant.The pathological staging,tissue grade,number of tumors and expression of p-mTOR were identified as independent prognostic factors for bladder cancer by univariate and multivariate Cox regression analysis.ConclusionThe mTOR/p-mTOR/p-p70S6K pathway was correlated with tumor oncology and tumor progress, p-mTOR protein was an independent prognostic factor for bladder cancer.

Mammalian target of rapamycin;ribosomal protein S6 kinase;urothelial bladder cancer

R730.261

A

1007-6948(2013)06-0639-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.06.009

1.天津市南开医院泌尿外科（天津 300100）

2.天津医科大学第二医院泌尿外科（天津 300211）