组织芯片检测Claudin-3在前列腺癌中的表达

朱永锋，张春霆，张洪团，张昌文，徐 勇

组织芯片检测Claudin-3在前列腺癌中的表达

朱永锋1，张春霆2，张洪团3，张昌文3，徐 勇3

目的：检测Claudin-3在前列腺癌中的表达情况，探讨其与前列腺癌发生发展的关系。方法：采用组织芯片技术构建包含64例前列腺癌和39例前列腺增生组织的64点阵石蜡组织芯片，用免疫组化SP法检测该芯片中Claudin-3的表达，分析其与前列腺癌Gleason评分和临床分期的关系。结果：前列腺癌Claudin-3阳性表达率为60.94%（39/64），前列腺增生表达率17.95%（7/39）（P＜0.05）；Claudin-3与前列腺癌Gleason评分和临床分期明显相关。结论：Claudin-3异常表达与前列腺癌发生发展有密切关系。

前列腺癌；Claudin-3；组织芯片；免疫组织化学

前列腺癌的发生进展是一个多因素多阶段的过程，涉及多个基因突变及表达异常。Claudins是紧密连接结构中的重要组成部分，其结构和功能的改变是许多疾病的基础[1]，其家族成员Claudin-3与前列腺癌的关系未见报道。我们利用组织芯片技术和免疫组织化学染色链霉菌抗生物素蛋-过氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法，对Claudin-3在前列腺癌中的表达情况进行了检测，探讨其与前列腺癌的临床病理联系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 64例前列腺癌组织标本来自浙江大学金华医院和天津医科大学第二医院2007年1月—2010年1月病理组织库标本，患者年龄57～69岁，平均（54.5±8.5）岁。前列腺增生组织取自同期非肿瘤患者，39例患者年龄52～71岁，平均（56.5±6.5）岁。两组年龄相比无显著性差异。前列腺癌根据2002年TNM分期标准，I～II期41例，III～IV期23例。Gleason评分＜7分的36例，Gleason评分≥7分的28例。前列腺癌术前均未接受放疗、化疗和内分泌治疗，标本经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，3 μ m厚连续切片。

1.2 方法 SP试剂盒和DAB显色剂均为北京中杉生物技术公司产品。构建2个8×8点阵的组织芯片，一个用于免疫组化染色，一个用于阴性对照。对所制成芯片的所有组织（须有与其匹配的标记完成的HE片）进行点阵。根据标记，利用点阵仪对标记完成的组织进行打点取样，黏附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上。每例前列腺癌标本和前列腺增生组织标本均取1个点。烤片6 h，芯片制作完成。应用SP法进行兔抗人Claudin-3蛋白单克隆抗体免疫组化染色。组织切片60℃烤片，常规脱蜡、抗原修复，0.3%H2O2-甲醇封闭内源性过氧化物10 min，滴加一抗（1∶100），4℃冰箱过夜。以PBS代替一抗作阴性对照。次日滴加生物素标记的二抗（兔）及链霉菌抗生物素-过氧化物酶，均室温孵育12 min。各步骤间均以0.1%Tween-PBS洗5 min×3次。最后DAB显色，常规脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.3 结果判定 Claudin-3染色主要是细胞膜出现棕红色颗粒为阳性染色，细胞浆及细胞核表达很少，根据阳性表达细胞数区分表达等级。（-）为阳性表达细胞数＜10%，（+）为阳性表达细胞数10%～25%，（++）为阳性表达细胞数＞50%，（+++）为阳性表达细胞数＞75%。阳性表达细胞数＞10%阳性表达，阳性表达细胞数≤10%为阴性表达。

1.4 统计学处理 运用SPSS 16.0软件进行统计学分析，对染色结果用成组设计两样本阳性率比较进行χ2检验（或者Fisher概率法），P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Claudin-3在前列腺癌中的表达 免疫组化染色结果发现，Claudin-3主要表达在细胞膜上，而在胞质及胞核中表达不明显（见图1、图2）。

图1 Claudin-3在前列腺增生组织中的表达（×100）

2.2 Claudin-3在前列腺癌和增生组织中的表达Claudin-3在前列腺癌中呈高表达，染色强度及阳性细胞数明显高于前列腺增生组织。在前列腺癌组织中表达的阳性率为60.94%（39/64），在前列腺增生组织中阳性表达率为17.95%（7/39）。见表1。

2.3 Claudin-3表达与前列腺癌Gleason评分和临床分期之间的关系 Claudin-3在36例前列腺癌＜7分的阳性表达率为41.67%（15/36），Claudin-3在28例前列腺癌≥7分的表达率为85.71%（24/28），两者之间比较有差异。在前列腺癌临床分期中，I～II期表达率53.66%（22/41）和III～IV期阳性表达率为82.61%（19/23），两者相比有明显差异。见表1。

表1 Claudin-3在前列腺癌和前列腺增生组织中的表达

3 讨论

前列腺癌是欧美国家常见的肿瘤[2]，其疾病特异性死亡率有上升趋势[3]。近年来，前列腺癌在我国呈逐渐增加趋势[4]。由于我国目前大多不能早期发现，同时很大一部分患者由于发现较晚，亦错失手术时机。随着分子生物学的发展，人们对前列腺癌的发生、发展机制的认识有了长足的进步。研究发现，前列腺癌与多种基因有关。Claudin-3基因参与了多种肿瘤的发生进展，其翻译的蛋白属于一类跨膜紧密连接蛋白，主要作用是维持细胞的极性和细胞间屏障功能[5-6]，在跨膜蛋白在细胞间的传输转运中起着重要作用，也是细胞黏附功能的基础。其异常表达使上皮渗透屏障破坏,细胞极性丧失,细胞间黏附力下降,导致肿瘤的发生发展[7-8]。

Claudin-3蛋白及其他紧密连接蛋白的表达异常，目前被认为是细胞间黏附性丢失的机制和肿瘤细胞发生及转移的重要步骤。然而在多数肿瘤组织中，Claudin-3表达水平明显较正常组织中高，这意味着Claudin-3表达的上调在肿瘤的发生中也起促进作用。本研究采用组织芯片技术，对前列腺癌组织和前列腺增生组织进行了研究，检测结果发现，在前列腺癌和良性前列腺增生组织中表达水平有显著的差异，在前列腺癌组织中Claudin-3表达的阳性率为60.94%（39/64），在前列腺增生组织中阳性表达率为17.95%（7/39）。结果表明，Claudin-3在前列腺癌和良性前列腺增生组织表达变化与前列腺癌的发生发展可能有密切关系。进一步研究发现，前列腺癌中36例Gleason评分＜7分的阳性表达率为41.67%（15/36），在28例前列腺癌Gleason评分≥7分的表达率为85.71%（24/28），两者之间比较有差异。在对前列腺癌临床分期中，I～II期表达率53.66%（22/41），III～IV期阳性表达率为82.61%（19/23），两者相比有明显差异。说明其表达与前列腺癌的临床分期和Gleason评分有关，Claudin-3的异常表达参与了前列腺癌的发生和进展。本研究利用Claudin-3与产气荚膜梭菌肠毒素 (clostridium perfringens enterotoxin，CPE)的受体结合，靶向干扰Claudin-3，前列腺癌细胞系PC3/DU145细胞增殖能力下降，细胞迁移能力降低。据此可以通过CPE作为载体，为靶向干扰Claudin-3对前列腺癌细胞产生特异性的细胞溶解作用[9]。靶向干扰Claudin-3表达上调的肿瘤治疗新方法提供理论和实验依据，为前列腺癌的治疗提供了新的思路。

本实验应用免疫组化SP技术对组织切片观察，发现Claudin-3在前列腺癌中高度表达，其表达主要在细膜上，而在胞质及胞核中表达不明显。Claudin-3在前列腺癌的细胞膜中表达增强，这可能与它参与前列腺癌发生发展细胞信号传导有关。实验中，在前列腺增生组织Claudin-3亦呈低表达或无表达，这说明虽然Claudin-3在前列腺癌中的表达不具有特异性，但前列腺癌早期即发现有Claudin-3异常表达，也使Claudin-3在前列腺癌的早期诊断中可能具有重要价值。同时，前列腺增生时的低表达说明Claudin-3在前列腺癌的发生中可能具有非常重要的作用，其在肿瘤转移和增殖中可能发挥非常重要的作用。国内毕罡等[10]采用免疫组化法半定量测定前列腺癌80例、前列腺增生组织20例中Claudin-3的表达，并用蛋白印迹结合图像分析法定量测定前列腺癌和前列腺增生组织的Claudin-3的表达，结果也显示，前列腺癌组织中Claudin-3的表达显著高于良性前列腺增生组。据此推测，Claudin-3可能对诊断前列腺癌有辅助诊断作用，Claudin-3可能是前列腺癌发生和演进中的早期事件之一。研究显示，Claudin-3表达上调促进肿瘤生长机制可能是：Claudin-3表达的上调是促进癌细胞的侵袭力和生存力,而这种效应可能与增强了基质金属蛋白酶-2的活性有关[11]。Claudin-3可被WNK4激酶催化磷酸化，推测Claudin-3可能有磷酸化后破坏细胞间紧密连接的正常功能。最近对Claudin-1研究结果显示，Claudin-1过表达还可以抑制E-cadherin表达，失去E-cadherin表达使E-cadherin/Tcf信号通路上调[12]。但是Claudin-3在前列腺癌中表达上调是否有相同的机制起作用，还需要进一步研究。

本研究将组织芯片技术和免疫组化技术相结合，同时对多个前列腺癌和前列腺增生组织进行了Claudin-3蛋白的检测，相对于普通切片，具有以下优点：⑴体积小，信息含量高；⑵最大限度地利用有限的标本资源；⑶适用于形态学观察，并可进行免疫组织化学染色的观察和研究；⑷高效、快速、低消耗、自身内对照，可比性强。我们的研究结果显示Claudin-3表达的上调与前列腺癌的发生发展相关,在前列腺癌的发生发展中起了重要作用。但Claudin-3功能复杂多样，其在前列腺癌发生进展中的作用远未阐明，尚需更进一步研究。

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（收稿：2012-12-09 修回：2013-09-12）

（责任编辑 张亚强）

Expression and Significance of Claudin-3 in Prostate Cancer with Tissue Microarray

ZHU Yong-feng,ZHANG Chun-ting,ZHANG Hong-tuan，et al Department of Urology,Jinhua People’s Hospital of Zhejiang Province,Jinhua(321000),China

ObjectiveTo investigate relationship of the generation and development of prostate cancer through detecting Claudin-3 expression of prostate cancer.MethodsTissue microarray technology were used to be built the lattice containing 64 patients with prostate cancer tissue and 39 patients with benign prostatic hy⁃perplasia tissue were arranaged for paraffin microarray and immunohistochemical SP method was used to detect Claudin-3 expression in the chip,the relationship between prostate cancer with Gleason score and the clinical stage was analyzed.ResultsIn 64 patients with prostate cancer,Claudin-3 positive expression rate was 60.94%(39/64),compared with in those with benign prostatic hyperplasia 17.95%（7/39）,there was significant difference,Claudin-3 expression in prostate cancer was significantly related to Gleason score and clinical stage（P＜0.05）.ConclusionAbnormal expression of Claudin-3 is closely related to generation and development of prostate cancer.

Prostate cancer Claudin-3;tissue microarray;immunohistochemistry

R737.25

A

1007-6948(2013)06-0636-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.06.008

1.浙江省金华市人民医院泌尿外科（金华 321000）

2.浙江大学金华医院泌尿外科（金华 321000）

3.天津医科大学第二医院泌尿外科（天津 300211）

徐 勇，E-mail:xuyong1955@sina.com