毛霉F-32产β-葡聚糖酶发酵条件优化及其对麦芽溶解性的影响

赵志超，贠建民*，艾对元，张紊玮，李怀生

(甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070)

毛霉F-32产β-葡聚糖酶发酵条件优化及其对麦芽溶解性的影响

赵志超，贠建民*，艾对元，张紊玮，李怀生

(甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070)

为提高微生物制麦过程中毛霉菌株F-32产β-葡聚糖酶酶活力以及改善麦芽溶解性，在单因素试验基础上，采用响应面试验设计法优化产酶条件，利用Design Expert 7.0软件对产酶结果进行二次回归分析，获得最佳的发酵条件：发酵温度30℃、发酵时间81h、接种量7.2%、初始pH6.0；对该条件下的菌株产酶情况进行验证，产酶力达到15.8775U/mL。并通过微生物制麦实验，该毛霉菌株F-32可以有效地提高甘啤4号大麦品种的制麦溶解性。

β-葡聚糖酶；产酶条件；响应面；优化；麦芽溶解性

β-葡聚糖酶是一类能降解谷物中β-葡聚糖的水解酶类的总称。该酶类包括内-β-1,3葡聚糖酶、外-β-1,3葡聚糖酶、外-β-1,4葡聚糖酶、内-β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶[1]。它们能够准确地作用于β-葡聚糖分子中的糖苷键，将大分子的β-葡聚糖降解成小分子量片段，失去亲水性和黏性，提高了富含β-葡聚糖的谷物类加工过程中的溶解速率[2]，因而在农产品加工和食品生产领域应用非常广泛。

麦芽是啤酒酿造的重要原料，在啤酒麦芽制造过程中，尽管大麦中β-葡聚糖的含量相对于多聚糖较低，但仍给麦汁生产和啤酒酿造造成不利影响[3]。而β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶和β-1,3-葡聚糖酶在此过程中对麦芽的溶解性起到至关重要的作用[4]，它们能够专一降解大麦β-葡聚糖中含量较多的β-1,3-糖苷键[5]，同时β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶还能降解β-葡聚糖混合糖苷键中与β-1,3-糖苷键接近的β-1,4-糖苷键，将大麦中的β-葡聚糖水解为纤维二糖和纤维三糖[6]，解决了β-葡聚糖含量过高而引起麦汁黏度高，过滤速率慢，麦汁产量低，非生物稳定性差等问题，有利于啤酒质量和稳定性的提高[7]。

为提高低发芽率大麦所制麦芽的溶解性，近年来出现了微生物制麦技术，即在制麦过程中添加启动子微生物菌株，利用微生物产生的外源性酶来协助大麦胚乳细胞壁的降解，进而改善麦芽品质[8]。目前，研究报道的制麦启动子微生物主要有可降解β-葡聚糖、木聚糖等大分子的菌种[9]。产β-葡聚糖酶的微生物，主要包括细菌和真菌，已报道的有：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[10-11]、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)[12]、盾壳霉2134(Coniothyrium minitans)[13]、康氏木霉(Trichoderma koningii)[14]、黑曲霉(Aspergillus niger)[15]、局限曲霉(Aspergillus restrictus)[16]。2007年，Teng Da等[17]将地衣芽孢杆菌中的分泌β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶基因转接到毕赤酵母细胞中并得到成功表达，基因优化后的表达水平在原来的基础上提高了10倍，其β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶活达到333.7U/mL。目前关于毛霉属(Mucor)产β-葡聚糖酶的菌株报道非常少。在长期的制麦生产研究中，本实验室已成功地从原料大麦中分离得到了一株产β-葡聚糖酶活较高的毛霉属菌株F-32，由于该菌株具有产孢子量少，生长适应性强的特点，非常适合于制麦工艺对启动子菌株的要求。为此，本实验以该菌株为研究对象，以其产酶能力作为评价指标，利用响应面法对其产酶条件开展进一步的优化，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，旨在为将该菌株成功应用于制麦工业生产提供科学依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大麦粉，甘肃武威长城麦芽厂提供甘啤4号大麦，粉碎过筛。

标准大麦β-葡聚糖(纯度≥95%) 美国Sigma公司。

1.2 菌种与培养基

毛霉F-32菌株(Mucor sp.)，甘肃农业大学食品科学与工程学院微生物研究室分离保藏，分离自大麦表面。

斜面培养基：PDA培养基[18]；液体产酶培养基：大麦粉3.0g、FeSO4g7H2O 0.001g、Na2HPO40.1g、CaCO30.5g、(NH4)2SO40.5g、MgSO4g7H2O 0.02g、NaNO30.4g、水100mL。以上培养基皆在121℃湿热灭菌20min后，方可使用。

1.3 发酵种子制备

用无菌水将孢子冲洗到液体产酶培养基中，调整孢子浓度为107，30℃恒温振荡培养48h。

1.4 葡萄糖标准曲线绘制

分别吸取1.0g/100mL的标准葡萄糖溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，配制成0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL/mg的标准液。取不同质量浓度葡萄糖标准溶液和蒸馏水各1mL于试管中，加1mL蒸馏水，3mL DNS试剂，混匀后，放入沸水中准确反应5.0min，取出后立即置于冰水浴中降温至室温，以空白管调零，在540nm波长处比色，以所得的吸光度为纵坐标，对应的标准葡萄糖溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线：y=1.31x—0.0048(R2= 0.9982)。空白对照：1.0mL的蒸馏水代替1.0mL的葡萄糖标准溶液，其他步骤同上。

1.5 β-葡聚糖酶活力测定

利用pH5.5的醋酸缓冲溶液将待测酶液稀释适当倍数，取经40℃预热的酶稀释液1.0mL和经40℃预热的质量浓度为1.0g/100mL的β-葡聚糖溶液1.0mL，混匀，于40℃恒温水浴准确反应10.0min，后加入蒸馏水1.0mL和DNS试剂3.0mL，摇匀，置于沸水中准确反应5min，取出并立即置于冰水浴中降至室温，以空白管调零，在540nm波长处比色，记录其吸光度。空白制作：吸取已稀释酶液1.0mL先加入DNS试剂3mL，再加入蒸馏水1.0mL和1.0g/100mL β-葡聚糖溶液1.0mL，其他步骤同上。

酶活力定义：在40℃、pH5.5条件下，每分钟分解大麦β-葡聚糖产生1μmol还原糖为1个酶活力单位，以U/mL表示。

酶活力/(U/mL)=(Ah0.7633+0.0037)hDfh1000/180t

式中：A为吸光度；Df为待测酶液的稀释倍数；t为反应时间/min；180为葡萄糖的摩尔分子质量/(g/mol)；1000为单位换算倍数。

1.6 单因素试验设计

在初始产酶培养基的基础上，对发酵温度、发酵时间、接种量、初始pH值4个因素进行单因素试验，以确定各因素影响产酶能力的水平区间。

1.7 响应面法试验设计与处理

根据单因素试验确定的影响产酶能力的水平区间，进行响应面设计；以产酶量为响应值，利用Design Expert 7.0对试验结果进行回归分析，建立回归方程，获得该菌株发酵产β-葡聚糖酶的最佳条件。

1.8 麦芽溶解性实验及其溶解性指标的测定

1.8.1 制麦工艺

浸麦(29h)：浸6h断9h→浸4h断6h→浸4h，18℃；发芽(96h)：16℃，相对湿度95%；焙燥(22h)：45℃、5h→50℃、6h→60℃、6h→70℃、2h→83℃、3h。

1.8.2 溶解性指标测定

β-葡聚糖、浸出率、过滤速率和黏度指标参考QB/T 1686ü2008《啤酒麦芽》。

β-葡聚糖酶酶活力的测定：称取2g样品，加入pH6.0的醋酸缓冲液充分研磨，离心10min，其他步骤同1.5节。

2 结果与分析

2.1 不同发酵温度对产β-葡聚糖酶活力的影响

图 1 不同发酵温度对发酵产β-葡聚糖酶酶活力的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on β-glucanase activity

温度的变化直接影响到微生物生长代谢过程。为探寻供试菌株产β-葡聚糖酶适宜温度范围，在250mL三角瓶装液量80mL、接种种子悬液5.0%、初始pH6.5、200r/min振荡培养96h的条件下，将温度分别控制在18、21、24、27、30、33、36℃，考察其对产酶能力的影响，结果见图1。发酵温度在30℃之前，该菌株的产酶能力随着温度的升高而增强，30℃时达到最大值，酶活力为15.2069U/mL；温度高于30℃时，产酶能力有所下降。这是由于高温对毛霉菌丝体生长的产生了抑制作用[19]，导致产酶量降低，使得β-葡聚糖酶活力迅速下降。故初步选择30℃为最适发酵温度。

2.2 不同发酵时间对产β-葡聚糖酶活力的影响

发酵时间对产酶能力的影响主要是通过影响微生物的生长曲线而产生作用。在250mL三角瓶装液量80mL、接种种子悬液5.0%、初始pH6.5、恒温30℃、200r/min振荡培养的条件下，分别设置培养时间40、48、56、64、72、80、88、96h，考察其对产酶能力的影响，结果见图2。

图 2 不同发酵时间对发酵产β-葡聚糖酶酶活力的影响Fig.2 Effect of fermentation time on β-glucanase activity

由图2可知，发酵时间从40h延长到72h时，该菌株的产酶能力随着发酵时间的延长而增强，80h后增长趋于平缓，这是由于菌体生物量不断增大，菌体对营养物质的竞争，出现营养缺乏，导致菌体本身的生长停滞，胞外酶在缺少底物诱导的情况下也停止分泌，故初步选择80h为最适发酵时间。

2.3 不同初始pH值对产β-葡聚糖酶活力的影响

图 3 不同初始pH值对发酵产β-葡聚糖酶酶活力的影响Fig.3 Effect of initial pH on β-glucanase activity

微生物的生长代谢和产酶活力都有一定的pH值适应范围，合适的pH值对菌株的生长代谢具有促进作用，可提高菌株的产酶活力。在发酵温度30℃、200r/min发酵80h、接种量5.0%、250mL三角瓶装液量80mL的条件下，利用0.12mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液将液体培养基pH值调整至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，经pH计监测30s内保持稳定，观察其对该菌株发酵产β-葡聚糖酶能力的影响，结果见图3。该菌株产酶能力受到pH值的影响较为显著，在pH6时菌株的产酶能力出现高峰，酶活力达到15.4043U/mL；低于或超过pH6时都会出现明显的下降趋势，说明该菌株生长的最适pH值或者所产酶的最适pH值为6，属弱酸性，故初步确定pH6为最适初始pH值。

2.4 不同接种量对产β-葡聚糖酶活力的影响

采用合适的接种量能够有效地缩短发酵时间，使产酶高峰提前[20]。在初始pH6.5、发酵温度30℃、200r/min培养72h、250mL三角瓶装液量80mL的条件下，考察接种量对发酵产β-葡聚糖酶能力的影响，结果见图4。

图 4 不同接种量对发酵产β-葡聚糖酶酶活力的影响-glucanase activityFig.4 Effect of inoculum amount onβ

由图4可知，当接种量为1.0%时，菌体的滞留适应期延长，菌株产酶能力在短时间内不能快速表达，而接种量达到2.5%以上时，产酶能力呈直线趋势迅速增长，超过7.5%时，其增长趋势逐步放缓，考虑到生产过程种子培养成本，选择7.5%为最适接种量。

2.5 响应面设计方案与分析结果

根据单因素试验结果，选取发酵温度(A)、发酵时间(B)、接种量(C)、初始pH值(D)4个因素每个自变量的低、中、高水平分别编码为—1、0、+1，共29个试验，其中24个为析因试验，5个为中心试验，以估计误差。以产酶活力作为响应值(Y)，采用Design Expert 7.0对试验结果进行回归分析。因素及水平设计方案与结果见表1。

利用Design Expert 7.0软件对表1数据进行多元二次回归拟合，得到全模型回归方程：

Y=—1110.26+24.40786A+9.48073B+13.14704C+ 111.9576D—0.02148AB+0.0488AC—0.39317AD—0.02994BC—0.14825BD—0.8804CD—0.3464A2—0.0479B2—0.4859C2—6.92657D2

对回归方程进行的方差分析结果见表2。

表 1 Box-Behnken试验设计与结果Table 1 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表 2 回归模型方差分析Table 2 Analysis of variances for the fi tted regression model

表2分析结果表明，在供试温度27～33℃范围内，因素A对该菌株产β-葡聚糖酶能力的影响不显著(P＞0.05)；因素B对该菌株产β-葡聚糖酶能力的影响显著(P＜0.05)，由于随着发酵时间的延长，菌体生长经由指数期到达稳定期，生物量积累增多，因而产酶量也会随之增加。因素C和因素D对其影响极显著，说明在其他条件不变的情况下，应严格控制接种量和初始pH值，以保证最大限度地产酶。交互项CD显著，其他不显著；二次项对其影响均极显著。该回归模型P值小于0.0001，表明二次方程模型达到极显著水平，模型失拟项P值为0.0861(＞0.05)，模型失拟项不显著，即该模型在整个研究回归区域拟合的较好。

根据数据分析表明，其复相关系数R2=0.9716，表示这4个因素及其二次项能解释Y值变化的97.16%。说明模型相关性较好；校正决定系数R2Adj=0.9432，说明94.32%的试验数据的变异性可用此回归模型解释；该试验的精密度达到17.718，大于纯误差值4.0，结果合理。综上所述，可以使用该模型来分析响应面值的变化。

利用Design Expert7.0软件，根据回归方程绘制相应的响应曲面图进行可视化分析，由图5可知，各交互因素存在一个最佳的水平组合使产酶活力达到最高。图5a、b、c显示，发酵温度与其他3个因素组合时，均在28.5～31.5℃范围内产β-葡聚糖酶活力达到最大值，说明该温度范围适宜菌株F-32生长，较快积累生物量，使β-葡聚糖酶活力提高；如图5c、d、e所示，菌株产β-葡聚糖酶活性最高时，初始pH值都处于5.75～6.25之间，说明偏酸性环境符合该菌株的生长和产酶条件。由响应面图可知，因菌体生物量的积累而引起产酶变化的发酵时间和接种量也分别在76～84h和6.25%～8.75%范围内使产酶活力达到最高值。

图 5 各因素交互作用对发酵产酶能力影响的响应面图Fig.5 Response surface plots for the effects of fermentation conditions on β-glucanase activity

由全模型回归方程可以看出，响应面存在最大值。经软件分析得出β-葡聚糖酶预测产量最大时的各因素取值分别是：发酵温度29.87℃、发酵时间80.88h、接种量7.18%、初始pH5.91，预测值为15.8596U/mL。

为了验证回归模型预测值的准确性，以响应面分析得到的最佳产酶条件进行产酶发酵实验，同时考虑到实际操作的可行性，将最佳条件修改为：发酵温度30℃、发酵时间81h、接种量7.2%、初始pH6.0。经过3次重复实验得到β-葡聚糖酶活力的平均值为15.8775U/mL。由此可见，该回归模型能用于β-葡聚糖酶发酵条件的预测。

2.6 供试菌株对麦芽溶解性的影响

以供试毛霉F-32菌株的上述试验筛选的最佳产β-葡聚糖酶条件为参考依据，利用3种不同海拔产地甘啤4号大麦进行微生物制麦实验，考察菌株对麦芽溶解性的影响，结果见表3。

表 3 不同产地大麦微生物制麦指标Table 3 Effect of Mucor F-32 on malt quality of barleys from different growing areas

由表3可知，添加了启动子培养菌株毛霉F-32的麦芽与空白实验相比较，β-葡聚糖酶活力、浸出率和过滤速率3个指标均有所提高，β-葡聚糖含量和麦汁黏度也有明显降低。可见，在溶解性较差大麦制麦过程中，该产β-葡聚糖酶毛霉菌株能够利用自身的产酶特性协助麦芽胚乳细胞壁进一步降解，有效改善麦芽溶解性，显著提高麦芽利用率，可作为制麦启动子菌株使用。

3 结 论

3.1 通过单因素试验设计，确定了影响产酶能力的4个因素：发酵温度、发酵时间、接种量和初始pH值的水平区间，分别为发酵温度27～33℃、发酵时间72～88h、接种量5.0%～10.0%、初始pH5.5～6.5。

3.2 利用Design Expert 7.0对响应面试验设计结果进行分析，并建立产酶活力回归模型，确定了各因素的最佳取值水平，即最佳产酶活力的条件分别为：发酵温度30℃、发酵时间81h、接种量7.2%、初始pH6.0；该条件下菌株产β-葡聚糖酶活力为15.8775U/mL，其可靠性在响应值的95%预测区间内。由此可以说明，运用该回归模型对该菌株进行产β-葡聚糖酶活力条件的预测是合理的。

3.3 将供试菌株作为微生物制麦的启动子添加到制麦过程中，观察其对麦芽溶解特性的影响，结果表明微生物麦芽的溶解性指标均有所改善，麦芽溶解特性有显著提高。

[1] 任海霞, 祝德义, 郭利美, 等. β-葡聚糖酶产酶培养基的优化[J]. 现代食品科技, 2005, 21(1): 39-42.

[2] 熊涛, 徐立荣, 曾哲灵. β-葡聚糖酶的研究进展[J]. 四川食品与发酵, 2006(6): 1-4.

[3] NUUTILA A M, RITALA A, SALMENKALLIO-MARTTILA M, et al. Improvement of malting quality of barley by complementing the malt enzyme spectrum[J]. Phytochemistry Reviews, 2002, 1: 135-140.

[4] WANG Junmei, ZHANG Guoping, CHEN Jinxin, et al. The changes of β-glucan content and β-glucanase activity in barley before and after malting and their relationships to malt qualities[J]. Food Chemistry, 2004, 86: 223-228.

[5] LU Ping, FENG Mingguang, LI Weifen, et al. Construction and characterization of a bifunctional fusion enzyme of Bacillus sourced β-glucanase and xylanase expressed in Escherichia coli[J]. FEMS Microbiology Letters, 2006, 261(2): 224-230.

[6] WOLF M, GECZI A, SIMON O, et al. Genes encoding xylan and beta-glucan hydrolysing enzymes in Bacillus subtilis: characterization, mapping and construction of strains deficient in lichenase, cellulase and xylanase[J]. Microbiology, 1995, 141(Pt2): 281-290.

[7] NOOTS I, DERYCKE V, CORNELIS K, et al. Degradation of starchy endosperm cell walls in nongerminating sterilized barley by fungi[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(2): 975-981.

[8] 朱俊勤, 李崎, 孙军勇, 等. 微生物制麦技术研究进展[J]. 啤酒科技, 2005(1): 11-14.

[9] PLANAS A. Bacterial 1,3-1,4-β-glucanases: structure, function and protein engineering[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2000, 1543(2): 361-382.

[10] 韩晶, 李宝坤, 贺家亮, 等. 高产嗜热β-葡聚糖酶菌种的诱变选育研究[J]. 酿酒科技, 2009(8): 47-51.

[11] 韩晶, 李宝坤, 李开雄, 等. 耐热β-葡聚糖酶产生菌AS35产酶条件的研究[J]. 中国食品添加剂, 2010(2): 166-170.

[12] TENG Da, FAN Ying, YANG Yalin, et al. Codon optimization of Bacillus licheniform is β-1,3-1,4-glucanase gene and its expression in Pichia pastoris[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74: 1074-1083.

[13] ZANTINGE J L, HUANG H C, CHENG K J. Induction, screening and identification of Coniothyrium minitans mutants with enhanced β-glucanase activity[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 32(2): 224-230.

[14] 王金玲, 何国庆, 吕长山. 响应面法优化康氏木霉产β-葡聚糖酶的液体发酵条件[J]. 食品工业科技, 2010, 31(9): 204-207.

[15] 贺小贤, 姜绪林. 黑曲霉β-葡聚糖酶产酶培养基的研究[J]. 食品工业科技, 2003, 24(12): 21-23.

[16] 孙玉英, 王瑞明, 刘庆军, 等. β-葡聚糖酶高产菌株的分离筛选及其新菌种初步鉴定[J]. 酿酒科技, 2004(2): 25-27.

[17] TENG Da, WANG Jianhua, FAN Ying, et al. Cloning of β-1,3-1,4-glucanase gene from Bacillus licheniformis EGW039 (CGMCC 0635) and its expression in Escherichia coli BL21 (DE3)[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 72: 705-712.

[18] 杜连祥, 王昌禄, 鲁梅芳, 等. 工业微生物学实验技术[M]. 天津: 天津科学技术出版社, 1992: 188-196.

[19] 贺运春. 真菌学[M]. 北京: 中国林业出版社, 2008: 137-142.

[20] 潘丽军, 庞锐, 吴学凤, 等. 葡萄糖和木糖共发酵生产L-乳酸的培养基和培养条件响应面优化[J]. 食品科学, 2011, 32(9): 140-145.

Optimization of Fermentation Conditions for β-Glucanase Production by Mucor F-32 and Its Effect on Malt Solubility

ZHAO Zhi-chao，YUN Jian-min*，AI Dui-yuan，ZHANG Wen-wei，LI Huai-sheng
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Response surface methodology was used to optimize fermentation conditions for β-glucanase production by Mucor F-32. Quadratic regression analysis of the experimental data obtained was carried out using the software Design Expert 7.0. We established the optimum fermentation conditions as follows: fermentation temperature 30 ℃, fermentation time 81 h, inoculum size 7.2%, and initial pH 6.0. Under these conditions, the β-glucanase activity of fermentation broth was 15.8175 U/mL in validation experiments. The application of Mucor F-32 for malting Ganpi No.4 barley indicated a considerable improvement in malt solubility.

β-glucanase；production conditions；response surface methodology；optimization；malt solubility

TS261.2

A

1002-6630(2013)01-0199-06

2011-10-11

甘肃省科技重大专项计划项目(1002NKDH029)；甘肃省自然科学研究基金计划项目(1107RJZA128)

赵志超(1985ü)，男，硕士研究生，研究方向为发酵工程。E-mail：441993726@qq.com

*通信作者：贠建民(1968ü)，男，教授，博士，研究方向为生物工程。E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn