产β-葡萄糖苷酶甘草内生菌的筛选及对甘草黄酮转化的研究

张 琴，李艳宾,*，李 华

产β-葡萄糖苷酶甘草内生菌的筛选及对甘草黄酮转化的研究

张 琴1,2，李艳宾1,2,*，李 华1

甘草黄酮类成分是甘草重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、增强心血管功能、增强免疫力等作用[1-3]，在医药、保健品、化妆品、食品添加剂等方面有广泛应用。自然界中黄酮化合物多以苷类形式存在，少部分为游离苷元[4]。目前已从甘草黄酮中鉴定出150余个化合物[5]，主要药效成分为甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷4类[6]，其中甘草苷、异甘草苷是甘草素与异甘草素的酚羟基被葡萄糖以β-葡萄糖苷键联接而成的糖苷型。

酚羟基是黄酮发挥作用的主要功能基团，其一旦成苷，往往造成生物活性的降低甚至丧失[7-8]。且苷元的酚羟基被葡萄糖取代后，极性增大脂溶性降低，从而影响到药效强度及药代动力学过程，导致生物利用度下降，人体吸收慢，不能很好发挥药效[9-12]。针对黄酮糖苷和苷元的转化，多采用醚化、酯化、酰基化等化学衍生反应水解黄酮糖苷来生产苷元。但化学反应过程易使苷类物质结构发生改变，水解产物复杂，且反应过程易屏蔽掉酚羟基，降低黄酮抗氧化活性[13]。微生物在生长过程中能产生丰富的酶系，通过微生物酶的催化作用，能使某些中药的化学成分发生结构变化。微生物转化法在沙棘黄酮、大豆异黄酮、苜蓿黄酮等方面已有较多研究[12,14-15]，但对甘草黄酮却鲜有报道。

植物内生菌是指定殖在健康植物体内并与植物建立和谐关系的一类微生物，内生菌不仅能够参与植物次生成分的合成，还可对植物次生代谢产物进行转化[16-17]。有学者对甘草内生菌开展了相关研究，结果表明甘草中也有着数量较多的内生菌[17-18]，但目前研究多集中在对甘草内生菌资源的调查方面，而对其是否可作为甘草有效成分微生物转化的菌种筛选源未见报道。为此本研究在分离与甘草生物相容性好的内生菌的基础上，从中筛选高产β-葡萄糖苷酶微生物菌种，以期实现黄酮糖苷的有效转化。同时结合本课题组前期初步探索出的微生物发酵处理从甘草渣中提取黄酮的工艺[19-20]，以期为后期建立甘草渣中黄酮的微生物同步提取与转化提供菌种材料与技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘草为新疆阿拉尔市附近野生胀果甘草(Glaycyrrhiza inf l аte Bat.)，于2009年5ü8月在不同生长点采集。

甘草素、甘草苷、异甘草素、异甘草苷标准品(纯度＞98%)，购自安徽芜湖甙尔塔医药科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

EQ-200粉碎机 武义县屺立工具有限公司；GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱、PX-9272MBE数显电热培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；AR1140精密电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SHZB金怡水浴恒温振荡器 江苏省金坛市医疗仪器厂；LDZX-50KB立式电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；DK-8D型电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司；721可见分光光度计 上海箐华科技有限公司。

1.3 培养基

1.3.1 分离培养基

内生细菌的分离采用牛肉膏蛋白胨培养基；内生真菌的分离用PDA培养基；内生放线菌的培养基选用高氏1号。

1.3.2 发酵培养基

细菌培养基：CMC-Na 10g、蛋白胨10g、KH2PO42g、NaCl 2g、MgSO4g7H2O 0.04g、水1000mL，pH 7.0。

真菌及放线菌培养基：CMC-Na 10g、(NH4)2SO42g、KH2PO42g、NaAc 1g、CaCl20.5g、MgSO4g7H2O 0.2g、ZnCl20.02g、FeSO40.01g、CoCl20.017g、水1000mL，pH 5.6。

1.4 方法

1.4.1 甘草内生菌的分离与纯化

采集到的新鲜甘草植株洗净，将根、茎、叶分开并装入烧杯中，用2.5g/100mL的NaClO分别将根、茎浸泡5min、叶浸泡2min，无菌水冲洗3次后再用75%乙醇分别浸泡5min和1min，再用无菌水冲洗3～4次，最后1次清洗的水涂布至牛肉膏蛋白胨培养基平板中检查表面消毒效果。

经表面消毒的甘草根茎叶分别用无菌粉碎机粉碎，取少量均匀撒在分离培养基上，细菌28℃、真菌与放线菌30℃条件下培养箱中培养。每天进行观察，菌体长出后根据菌落及菌体形态以划线法分别转接至相应的培养基上进行纯化，最终得到纯培养菌株。

1.4.2 产β-葡萄糖苷酶内生菌的筛选

1.4.2.1 产酶发酵条件

1.4.2.2 β-葡萄糖苷酶活性测定

将发酵液在4500r/min离心15min，取上清酶液0.4mL，加入1.2mL 0.1mol/L的磷酸柠檬酸缓冲液(pH 5.0)、0.4mL 8mmol/L对硝基苯酚β-葡萄糖苷溶液充分混合，在45℃水浴锅中反应30min后加入2mL 0.5mol/L Na2CO3溶液终止反应，在400nm波长处测定吸光度[21]。以对硝基苯酚为标准对照品，配制不同浓度的标准溶液，各取2mL加入NaCO3溶液显色后测定吸光度。以吸光度为横坐标，对硝基苯酚浓度(μmol/L)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为：y = 108.8x – 1.9629(R2= 0.9992)。

1.4.3 β-葡萄糖苷酶高产菌株产酶动力学测定

根据各菌株β-葡萄糖苷酶活测定结果，筛选出GF10、GF19两株高酶活真菌。配制真菌发酵培养基进行发酵，方法和培养条件同上，5次重复。从第2天起每天测定酶活力，连续测定10d，方法同前。

1.4.4 甘草黄酮微生物转化及抗氧化测定

1.4.4.1 发酵粗酶液的制备

按GF10、GF19两株菌的最佳产酶周期进行发酵，发酵结束后6000r/min离心15min，并用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，既得粗酶液。每种菌重复3次，以未接菌培养基作空白对照。

调查历代碑志文献及历代字书材料，我们发现“冈”既是“罔”的俗字，作为构件时，又是“岡”的俗写。以“罔”“岡”为构件的字常出现同形相混现象，结果造成其俗讹字的对应关系异常复杂，难以准确分辨。因此，我们有必要彻底理清“罔”和“岡”演变过程，搞清楚同形字“冈”或构件“冈”形成的原因及时间，总结其演变规律，以便为相关俗字辨析、汉字发展史研究和文献整理提供切实参考。

1.4.4.2 甘草黄酮底物溶液的制备

[19]用80%乙醇从甘草渣中提取黄酮，在65℃条件下减压蒸馏除去乙醇并定容，再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得酶解底物。测得黄酮质量浓度为0.135mg/mL。

1.4.4.3 甘草黄酮的转化及抗氧化测定

将黄酮底物与粗酶液按体积比为3:1的比例在40℃水浴中酶解30min，结束后反应液进行DPPH自由基抗氧化实验，以未经转化的黄酮溶液为对照。

DPPH抗氧化实验参考文献[22]，采用分光光度测定法。DPPH用70%的乙醇配制成6.5h10-5mol/L的溶液，取4mL DPPH乙醇溶液，加入0.8mL待测液，摇匀，室温下反应15min，在517nm波长处测定吸光度，记作Ai；取4mL 70%乙醇溶液，加入0.8mL待测液，反应后测定吸光度，记作Aj；取4mL DPPH溶液，加入0.8mL蒸馏水，反应后测定吸光度，记作A0。DPPH自由基清除率按下式计算。

1.4.4.4 转化产物组成成分分析

采用HPLC法检测转化前后黄酮溶液中甘草苷、甘草素、异甘草苷及异甘草素4种成分的含量。仪器设备为：Waters Alliance HPLC 2695；色谱条件为：色谱柱SinoChrom ODS-BP 5μm，柱温25℃，柱压3100psi，流速1mL/min，检测波长260nm。采用混合标液进样，以甲醇-水为流动相梯度洗脱，程序如表1所示。

表 1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradual elution program for HPLC separation

标准曲线制备：用甲醇分别配制甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素溶液，再取适量进行混合，制备成不同浓度梯度的混合标准液，分别取10μL进样测定(其中甘草苷、异甘草苷质量浓度分别为2、5、10、15、20μg/L，甘草素、异甘草素质量浓度分别为1、2.5、5、7.5、10μg/L)，得回归方程和相关系数。甘草苷：Y=10100X–3880(R2=0.9987)；异甘草苷：Y=7060X–3710(R2=0.9986)；甘草素：Y=17400X–4080(R2=0.9984)；异甘草素：Y=14656X–3774.8(R2=0.9984)。

2 结果与分析

2.1 甘草内生菌的分离

从甘草根茎叶中共分离出47株甘草内生菌，根据菌落形态及显微镜观察结果，可分为内生真菌22株(GF1～GF22)，内生细菌12株(GB1～GB12)，内生放线菌13株(GA1～GA13)，结果见表2。不同甘草组织中内生菌的分布密度不同，其中根中的内生真菌有12株，占真菌总数的54.55%；其次为茎，分离到8株内生真菌，占36.36%；叶中最少，分离到2株内生真菌。内生放线菌也以茎和根中较多，分离到的菌株数分别占到46.15%和38.46%，叶中内生放线菌较少。内生细菌的数量则以叶中最多，分离到5株，占细菌总数的41.67%，根中相对最少。

表 2 甘草不同部位内生菌的分离结果Table 2 Results of endophyte isolation from different parts of Glycyrrhiza inf l ate

2.2 甘草内生菌产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选

对分离所得47株甘草内生菌进行了β-葡萄糖苷酶活力测定。结果发现，多数内生菌都能产β-葡萄糖苷酶，细菌、放线菌的酶活普遍较低，而甘草内生真菌的产酶能力普遍较好，其中GF10和GF19两株真菌酶活力分别高达18.63、18.04U，显著高于其余菌株，两株菌均分离自甘草根中。经广东微生物所鉴定两株菌分别为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和构巢曲霉(Emericella nidulans)，选择此两株高产β-葡萄糖苷酶菌株进行后续实验。

2.3 β-葡萄糖苷酶高产菌株产酶动力学的测定

图 1 GF10(A)和GF19(B)的β-葡萄糖苷酶产酶动力学曲线Fig.1β-Glucosidase production kinetics of GF10 and GF19

由图1可知，GF10在发酵8d内，酶活力总体呈增大趋势，在第8天时达到最高，此后酶活力开始下降，所以初步确定GF10的最佳发酵时间为8d。GF19在第4天达到产酶高峰，此后酶活稍有降低并趋于平稳，因此选择4d为其最佳发酵时间。

2.4 β-葡萄糖苷酶高产菌株酶转化对甘草黄酮抗氧化活性的影响

图 2 GF10、GF19产酶转化甘草黄酮对DPPH自由基的清除率比较Fig.2 DPPH radical scavenging rates of fl avonoids before and after transformation

由图2可知，经β-葡萄糖苷酶转化之后的黄酮溶液对DPPH自由基的清除率均有显著增加(P＜0.01)，GF10、GF19两株菌转化后黄酮的DPPH自由基清除率分别为71.67%、65.94%，比未经转化黄酮对照的清除率(20.68%)分别提高了246.57%、218.86%。可见，通过β-葡萄糖苷酶的转化，能够有效提高甘草黄酮的抗氧化活性。

2.5 β-葡萄糖苷酶转化前后甘草黄酮检测的主要组成成分

表 3 转化前后黄酮溶液中甘草苷、甘草素、异甘草苷及异甘草素的含量(x±s,n＝3)Table 3 Concentrations of liquiritin, isoliquiritin, liquiritigenin and isoliquiritigenin before and after transformation (x±s,n＝3)

由表3可知，相对于未经转化的对照，经微生物酶转化后的处理中甘草苷与异甘草苷的含量均有不同程度的降低，其中甘草苷下降的程度达到极显著水平(P＜0.01)，同时甘草素和异甘草素的含量增加极显著(P＜0.01)。其中，菌株GF19转化处理中的甘草素所占的比例最高，为29.18%，比转化前的(10.38%)提高了181.12%；异甘草素比例最高的是GF10处理，为8.64%，比转化前(4.27%)提高了102.34%。

3 结 论

在天然活性物质利用的过程中，往往通过理化或生物方法有意识地将其中的低效成分转化为高效成分。黄酮糖苷转化为苷元的途径主要有化学法及生物法，其中生物转化法备受关注，它是在温和的条件下发生作用，能克服化学反应的缺点，减少产物分解、异构、消旋和重排反应等不利因素，增加目标产物产量。生物转化法又主要有酶解转化与微生物转化两类，酶的专一性强，水解效率高，反应条件温和，得到的苷元产品稳定，因此被广泛用于黄酮苷元的水解制备[23-24]。微生物在生长过程中可产生多种酶类，且很多为分泌型胞外酶，这些种类丰富而活性显著的酶系可将黄酮糖苷分解转化为苷元。与酶解转化相比，微生物转化省去了酶分离纯化的环节，可以有效节省成本，且微生物产生的是复合酶系，可保证水解反应是在各种酶有机组合的条件下进行的，这比单一酶或简单几种酶组合的水解效率要高。相比较而言，微生物转化法更具应用前景，也因此成为近年来许多学者研究的热点之一[9,12,15]。

在黄酮苷类的微生物转化工艺中，转化菌种的选择十分关键。植物体内有着种类、功能均十分丰富的内生菌，本研究从甘草根茎叶中分离得到数量较多的内生细菌、真菌和放线菌，并从中筛选得到高产β-葡萄糖苷酶真菌2株，对甘草黄酮的转化结果表明，黄酮糖苷得到有效水解，苷元含量显著增加，抗氧化活性显著增强，证实甘草黄酮能利用微生物转化法进行结构转化，甘草内生菌可作为转化菌种的有效筛选源。与自然界中其他微生物相比，由于长期进化的关系，内生菌与寄主植物具有很好的生物相容性，不会受到寄主体内代谢产物的抑制，所以选用内生菌进行黄酮结构转化更能保证反应高效进行。由于目前甘草黄酮的提取源主要是甘草渣，结合甘草渣中黄酮的微生物法提取工艺[19-20]，下一步将开展分离提取菌种与转化菌种同步发酵的工艺研究。

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(1.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

对甘草内生菌进行分离，并从中进行高产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选，以利用微生物转化法将甘草黄酮糖苷水解成苷元，提高其抗氧化活性。结果从分离纯化出的47株甘草内生菌中筛选得到GF10和GF19两株高β-葡萄糖苷酶活性真菌，两株菌对甘草黄酮的转化实验结果表明：转化后黄酮的抗氧化活性均有显著增加，GF10、GF19对DPPH自由基的清除率分别达到71.67%、65.94%，比未经转化黄酮的清除率(20.68%)分别提高了246.57%、218.86%。对甘草黄酮主要成分的HPLC法检测结果表明，经微生物转化后，甘草苷与异甘草苷的质量浓度均有不同程度的降低，而甘草素和异甘草素的质量浓度则显著增加。其中GF19转化的处理，甘草素在4种黄酮物质中所占的比例最高，为29.18%，比转化前(10.38%)提高了181.12%；异甘草素比例最高的处理是GF10，为8.64%，比转化前(4.27%)高出102.34%。

甘草；内生菌；β-葡萄糖苷酶；甘草黄酮；转化

Isolation of β-Glucosidase-Producing Endophytes from Glycyrrhizа inf l аte and Their Effects on Flavonoid Transformation

ZHANG Qin1,2，LI Yan-bin1,2,*，LI Hua1
(1. College of Life Science, Tarim University, Alar 843300, China；2. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Tarim University, Alar 843300, China)

Forty-seven endophytes were isolated from different parts (root, stem and leaf) of Glycyrrhiza inflate and potent 2 β-glucosidase-producing strains, designated as GF10 and GF19, were screened out of them. GF10 and GF19 were comparatively evaluated for their effectiveness in microbial transformation of flavonoid glucosides in Glycyrrhiza inflate into aglycones to obtain higher antioxidant activity. Both strains could increase the antioxidant activity of fl avonoids, and the DPPH radical scavenging rates after fermentation with them were 71.67% and 65.94%, respectively, which were 246.57% and 218.86% higher than before fermentation (20.68%). HPLC analysis showed that the concentrations of liquiritin and isoliquiritin decreased to different extents after microbial transformation, whereas the concentrations of liquiritigenin and isoliquiritigenin signif i cantly increased. Liquiritigenin was the most abundant among four fl avonoids with a percentage of 29.18% after GF19 transformation, which was 181.12% higher than the original level (10.38%), while GF10 transformation made isoliquiritigenin the most dominant fl avonoid and its percentage was increased from its original level (4.27%) to 8.64% by 102.34%.

licorice；endophytes；β-glucosidase；licorice fl avonoids；transformation

TS201.1；Q939.9

A

1002-6630(2013)01-0194-05

2011-10-19

新疆兵团青年科技创新资金专项(2010JC38)；新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室开放课题(BR0804)

张琴(1980ü)，女，讲师，硕士，研究方向为微生物转化。E-mail：jhtabszq@163.com

*通信作者：李艳宾(1983ü)，男，讲师，硕士，研究方向为微生物发酵。E-mail：ydhant@163.com