结直肠癌线粒体DNA拷贝数改变及4 977片段缺失

王志津，郭晓明，张鋆歆，张振华，徐 伟，王小鹏

（1.中国人民解放军第三○五医院消化科，北京 100017；2.中国人民解放军第三○九医院老年病科，北京 100091；3.中国人民解放军第三○五医院病理科，北京100017）

结直肠癌线粒体DNA拷贝数改变及4 977片段缺失

王志津1，郭晓明2*，张鋆歆3，张振华1，徐 伟1，王小鹏1

（1.中国人民解放军第三○五医院消化科，北京 100017；2.中国人民解放军第三○九医院老年病科，北京 100091；3.中国人民解放军第三○五医院病理科，北京100017）

目的 探讨结直肠癌（colorectal cancer，CRC）线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷贝数异常、线粒体DNA 4 977 bp大片段缺失与TNM分期和分化程度的关系。方法选取118例石蜡标本大肠癌组织，分别提取总DNA。以ND1和β-actin为目的基因，进行SYBR Green荧光定量PCR扩增，并用PCR扩增方法检测4 977片段缺失情况，探讨它们与不同TNM分期和分化程度之间的关系。结果CRCⅠ和Ⅱ期癌组织平均拷贝数（2ND1/βactin）分别为128.42±31.25和115.12±47.15，Ⅲ和Ⅳ期癌组织平均拷贝数为105.22±16.35和99.45±28.46。Ⅰ和Ⅱ期的拷贝数明显高于Ⅲ和Ⅳ期的拷贝数（P＜0.01），癌组织低、中、高分化的平均拷贝数分别为101.34± 41.35、112.33±42.32和127.22±31.23（P＜0.01），4 977片段缺失率为15.25％（18/118），线粒体DNA4977bp缺失与患者的分期呈负相关，与分化程度无明显关系。结论线粒体DNA 4 977 bp缺失在大肠癌的早期阶段起到了重要作用，随着肿瘤的进展，拷贝数逐渐减少，线粒体DNA拷贝数的变化及大片段缺失在肿瘤的发病机制中可能起一定作用。

结直肠肿瘤；DNA，线粒体；聚合酶链反应

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）在全世界癌症的发生率和病死率中占第3位，严重威胁人们的健康。最近人们对氧化损伤可能导致肿瘤的推理产生了浓厚的兴趣，氧化损伤的靶器官作用于细胞的线粒体。与核DNA不同，线粒体DNA高水平存在于每个细胞中，通常有103～104拷贝［1］。随着人们对线粒体研究的深入，线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突变在很多部位的肿瘤中均有报道，如肺癌、食管癌、乳腺癌等［2-4］。mtDNA拷贝数及4 977片段的缺失是否随着大肠癌恶性程度而有所变化，目前尚不清楚。因此，本研究采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR对118例结直肠癌线粒体DNA拷贝数进行检测，并用PCR法检测4 977片段的缺失，以探讨CRC mtDNA拷贝数的差异及4 977片段缺失在不同TNM分期和分化程度中的变化。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2005年1月—2006年10月于我院手术切除的CRC患者118例，所有患者术前均未接受过放疗和化疗。男性61例，女性57例，年龄27～85岁，平均59.78岁。其中Ⅰ期8例，Ⅱ期55例，Ⅲ期40例，Ⅳ期15例；高分化33例，中分化64例，低分化21例，所有病理标本均经病理科2位专家重新诊断筛选。

1.2 试剂与仪器。

1.2.1 试剂：蛋白酶K（北京欣经科生物技术有限公司）；无水乙醇、二甲苯、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇（北京益利精细化工）；琼脂糖（Spain）；50×TAE（北京鼎国生物技术有限公司）；DL2000 Ladder（北京天根公司）；Escherichia coli DH10B感受态细胞（北京基因组研究所），质粒pGEM®-T Vector试剂盒（Promega美国），QIA快速PCR纯化试剂盒（QIAGEN公司，美国）。

1.2.2 仪器：GeneAmp PCR System 2700型PCR扩增仪（ABI公司，美国），荧光定量PCR仪（MJ Research公司，美国），低温高速离心机（SORVALL公司，德国），凝胶图像分析系统（Viber Lourmat，美国），-80℃低温冰箱（Sanyo，日本）。

1.3 方法

1.3.1 标本DNA提取：取术中切除的结肠癌标本，切取癌灶中心部分组织蜡块作为癌组织，取手术切缘的蜡块作为癌周组织，共118个病理标本蜡块，切5张10μm和1张4μm厚的切片。用经典饱和酚-氯仿-异戊醇法提取总DNA（包括核DNA和mtDNA）。将所得的DNA溶于双蒸水，-20℃冰箱保存备用。紫外分光密度仪检测所提取DNA浓度为（100.23±40.12）mg/L。

1.3.2 质粒的克隆及鉴定：选取mtDNA的ND1和核DNA的β-actin为目的片段，引物均为上海英骏生物工程技术服务有限公司合成，ND1引物序列，F 5'-TAATGCTTACCGAACGAA-3'，R 5'-TTATGGCGTCAGCGAAGG-3'，目的片段104 bp，β-actin引物序列，F5'-GCAAAGTTCCCAAGCACA-3'，R5'-AAGCA AGCAGCGGAGCAG-3'，目的片段105 bp，PCR反应体系（10μL）组成如下，rTaq酶0.08μL，10×buffer（Mg2+free）1μL，MgCl20.7μL，dNTPMixture 0.7μL，上下游引物1μL，模板DNA1μL，ddH2O 5.52μL。反应条件，94℃预变性5min，40个循环94℃变性30s、57℃退火45s、72℃延伸45s，最后72℃延伸10min。将PCR产物纯化回收，连接到pGEM-T载体上，并测序以验证。

1.3.3 标准曲线：ND1及β-actin基因标准曲线的制作是将带有目的基因的质粒DNA做108、107、106、105、104倍梯度稀释，并以这些稀释的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，根据不同浓度的标准品测得的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（threshold cycle，Ct）值绘制标准曲线。

1.3.4 荧光定量PCR：Sybergreen-I 0.5μL，10× buffer 1μL，dNTPMixture 0.25μL，上下游引物2μL，标准品或样品1μL，ddH2O 5.25μL，反应体系体积10μL。95℃预变性5min，40个循环95℃变性10s，60℃退火10s，68℃延伸20s。

1.3.5 线粒体DNA拷贝数的计算：核DNA被选择作为定量mtDNA拷贝数的内对照。由于β-actin基因是一个已知序列的核单拷贝基因，因此本实验选择其作为二倍体核基因组含量的标记。以mtDNA ND1和核单拷贝基因β-actin分别作为线粒体和核DNA拷贝数的标记，线粒体DNA的拷贝数/细胞= 2×ND1/β-actin。

1.3.6 线粒体DNA 4 977片段的缺失检测：检测线粒体DNA 4 977bp缺失突变的存在情况所用引物Fnt8 412～nt8 436，5'-TACTCCTTACACTATTCCTC-ATCAC-3'，261bp；Rntl 3 650～ntl 3 626，5'-GGGGAAGCGAGGTTGACCTGTTAGG-3'。

PCR反应体系（10μL）组成如下。DNA（100mg/L）2μL；10×buffer（Mg2+free）1μL；Mg2+（25mmol/L）0.5μL；dNTP（2.5mmol/L）0.5μL；primer（1pmol/L）1μL；LA-Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.1μL；ddH2O 4.9μL；总体积10μL。反应条件，94℃预变性3min→94℃变性30s、62℃退火30s、68℃延伸45s，共30个循环→72℃继续延伸10min。

如果样本能扩增出261bp片段，说明样本中有4 977bp片段的缺失。如果样本扩增不出片段，说明无缺失。

2 结果

2.1 结直肠癌组织线粒体DNA拷贝数：CRCⅠ和Ⅱ期癌组织平均拷贝数（2ND1/β-actin）分别为128.42±31.25和115.12±47.15，Ⅲ和Ⅳ期癌组织平均拷贝数为105.22±16.35和99.45±28.46。癌组织低、中、高分化的平均拷贝数分别为101.34± 41.35、112.33±42.32和127.22±31.23。Ⅰ、Ⅱ期平均数为117.24±40.21，高于Ⅲ、Ⅳ期的平均数102.23±30.56（t=2.26，P＜0.05），低分化组拷贝数明显低于高分化组（t=2.61，P＜0.01）。

2.2 结肠癌线粒体DNA 4 977bp片段缺失情况：Ⅰ期CRC中缺失6例，Ⅱ期CRC中缺失6例，Ⅲ期CRC中缺失5例，Ⅳ期CRC中缺失1例，总缺失率为15.25％（18/118）。癌组织低、中、高分化中4 977bp片段缺失分别是4、6、8例，CRC患者的癌组织中，线粒体DNA 4 977bp片段缺失与患者的分期呈负相关（χ2=23.98，P＜0.01），与分化程度无明显关系。

3 讨论

人体细胞，除了红细胞，都包含线粒体，细胞通过氧化磷酸化产生近95％的能源。mtDNA呈闭环双链，全长16 569个碱基，线粒体呼吸链氧化磷酸化不但与mtDNA结构的完整性相关，而且与其拷贝数相关，mtDNA拷贝数增加被认为总线粒体呼吸功能的代偿。线粒体DNA突变率是核DNA的10～100倍，这与mtDNA易受活性氧的攻击、缺乏组蛋白保护和基因修复能力有限等特性相关。在各种细胞、组织和器官的线粒体DNA的拷贝数是不同的，这种差异，也可能由于内部或外部微环境的改变而引起，包括缺氧和类固醇激素的刺激［5-6］。最近，因为这种细胞器扮演着各种角色而引起科学家们的兴趣，它包括能源生产、电子传输、细胞运动、细胞增殖和细胞凋亡等。已发现在许多肿瘤中，线粒体DNA出现点突变、编码区的突变和缺失。在mtDNA突变中，4 977bp片段缺失最常见［7］。本研究结果显示，结肠癌细胞中，mtDNA 4 977bp片段缺失与患者的分期呈负相关，这可能表明4 977bp片段缺失是肿瘤早期的一种表现。肿瘤在生长初期，在外界氧化应激损伤刺激下，细胞产生一些较小的线粒体，它可能成为维持细胞快速增殖，抑制细胞有氧呼吸，增加糖酵解的重要途径。

mtDNA的功能实现不但与其结构完整性有关，而且与其拷贝数有关。Thyagarajan等［8］发现mtDNA拷贝数的增加与乳腺癌的发生率呈正相关。但Dai等［9］发现在肺癌组织中mtDNA的平均拷贝数显著低于相邻正常的肺组织的拷贝数，并且发现微卫星不稳定组中mtDNA的拷贝数明显低于稳定组。线粒体对许多致癌因素敏感，它是产生活性氧的主要场所，也成为其主要的攻击目标。线粒体对活性氧高度敏感，当细胞受到外源性氧化剂攻击时mtDNA拷贝数增加。mtDNA拷贝数增加是总线粒体呼吸功能的代偿。但肿瘤生长时间长后，糖酵解占供能的比例逐渐增加，线粒体拷贝数增加逐渐下降，甚至可能低于正常。本研究发现CRC癌组织（Ⅲ和Ⅳ期）的mtDNA拷贝数显著低于Ⅰ和Ⅱ期，mtDNA拷贝数与肿瘤分化程度成负相关，中、低分化比高分化组的拷贝数低，恶性程度相对较高。低分化组的CRC癌组织mtDNA拷贝数与高分化组相比差异有统计学意义。早期CRC mtDNA拷贝数尚无明显变化，而到中晚期时癌组织mtDNA拷贝数已明显降低，预后较差。对于CRC mtDNA拷贝数的检测及大片段缺失可能为临床诊断、判断预后及复发提供一些参考。

［1］AL-KAFAJI G，GOLBAHAR J.High glucose-induced oxidative stress increases the copy number ofmitochondrial DNA in human mesangial cells［J］.Biomed Res Int，2013，13（7）：754946-754953.

［2］HOSGOOD HD 3RD，LIU CS，ROTHMAN N，et al.Mitochondrial DNA copy number and lung cancer risk in a prospective cohort study［J］.Carcinogenesis，2010，31（5）：847-849.

［3］LIN CS，CHANG SC，WANG LS，et al.The role of mitochondrialDNA alterations in esophageal squamous cell carcinomas［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2010，139（1）：189-197.

［4］TINA E，LINDQVIST BM，GABRIELSON M，et al.The mitochondrial transporter SLC25A43 is frequently deleted and may influence cell proliferation in HER2-positive breast tumors［J］. BMC Cancer，2012，12：350.

［5］POTENZA L，CALCABRINI C，DE BELLIS R，et al.Effects of reactive oxygen species on mitochondrial content and integrity of human anastomotic colorectal dehiscence：a preliminary DNA study［J］.Can JGastroenterol，2011，25（8）：433-439.

［6］JANG YO，QUAN X，DAS R，et al.High-dose clevudine impairs mitochondrial function and glucose-stimulated insulin secretion in INS-1E cells［J］.BMCGastroenterol，2012，12：4.

［7］MEISSNER C，RITZ-TIMME S.Molecular pathology and age estimation［J］.Forensic Sci Int，2010，203（1）：34-43.

［8］THYAGARAJAN B，WANG R，NELSON H，et al.Mitochondrial DNA copy number is associated with breast cancer risk［J］.PloS One，2013，8（6）：e65968.

［9］DAI JG，ZHANG ZY，LIU QX，et al.Mitochondrial genome microsatellite instability and copy number alteration in lung carcinomas［J］.Asian Pac JCancer Prev，2013，14（4）：2393-2399.

（本文编辑：赵丽洁）

COPY NUMBER CHANGE AND 4 977bp DELETION OFm tDNA IN COLORECTAL CANCER

WANG Zhijin1，GUO Xiaoming2*，ZHANG Yunxin3，ZHANG Zhenhua1，XUWei1，WANG Xiaopeng1（1.Department of Gastroenterology，305 Hospital of PLA，Beijing 100017，China；2.Department of Geriatrics，309 Hospital of PLA，Beijing 100017，China；3.Department of Pathology，305 Hospital of PLA，Beijing 100017，China）

Objective To study the relationship between mitochondrial DNA copy number abnormalities，4 977bp deletion with TNM and differentiation of colorectal cancer.M ethods Total DNA was extracted from cancerous tissues in 118 colorectal carcinoma samples.Using the SYBR GreenⅠquantitative polymerase chain reaction，the mitochondrial to nuclear DNA ratio was determined by quantification of ND1 andβ-actin.The detection of 4 977bp deletion was tested by PCR amplification. Results Mean 2ND1/β-actin DNA ratios for cancerous tissues of CRC in early stage（ⅠandⅡ）were 128.42±31.25 and 115.12±47.15，respectively，and were 105.22±16.35 and 99.45±28.46 respectively in advanced staged（ⅢandⅣ）CRC tissues.The copy number in early stagewas higher than that in advomced stage.The mean mtDNA copy number from poorly，moderately and well differentiated sampleswere respectively 101.34±41.35，112.33±42.32，127.22±31.23（P＜0.01）.The ratio of 4 977bp deletion was15.25％（18/118），and the deletion ofmitochondrial DNA 4 977bp was negatively correlated with the stage，and was no significant relationship with the differentiation degree.ConclusionThe mitochondrial DNA 4 977 bp deletion plays an important role in the early stages of colorectalcancer，and mtDNA copy numberswere negatively correlated with the differentiation degree，the variation of copy number and large deletions in mtDNA may play a role in the pathogenesis of tumors.

colorectal neoplasmsr；DNA，mitochondrial；polymerase chain reaction

R735.3

A

1007-3205（2013）11-1372-04

2013-07-02；

2013-09-24

王志津（1951-），男，天津人，中国人民解放军第三○五医院主任医师，医学硕士，从事胃肠道疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：gxm19775555@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.11.004