响应曲面法优化纤维素酶酶解提取工艺

石亚中，方娇龙，钱时权，伍亚华，李善菊，许 晖

(蚌埠学院生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

响应曲面法优化纤维素酶酶解提取工艺

石亚中，方娇龙，钱时权，伍亚华，李善菊，许 晖

(蚌埠学院生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

为优化纤维素酶酶解提取白藜芦醇工艺，在单因素试验的基础上进行响应面试验，选择酶添加量、酶解时间和酶解温度为自变量，以白藜芦醇含量为响应值。结果表明：3个因素对白藜芦醇提取效果影响的主次顺序依次为酶添加量＞酶解时间＞酶解温度，酶添加量为极显著影响因素，酶解时间和酶解温度影响不显著。确定纤维素酶酶解处理山葡萄渣白藜芦醇提取工艺的最佳条件为酶添加量1.30mg/g、酶解时间1.48h、酶解温度55.49℃，在此条件下提取得到的白藜芦醇含量为0.746mg/g，是优化前提取得到的白藜芦醇含量的1.15倍。

白藜芦醇；纤维素酶酶解；响应曲面分析法

白藜芦醇(Resveratro1)是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，1940 年由日本人首次从毛叶藜芦(Veratrum grandifl orum O. Loes)的根中获得[1-2]。研究发现白藜芦醇具有抗癌、抗菌、抗氧化、心血管保护等多方面的生物药理作用[3-13]。葡萄中含有丰富的白藜芦醇，尤以葡萄皮和葡萄籽中含量最多[14-15]。

目前白藜芦醇的提取方法主要有有机溶剂法、热水浸提法、超声波法、超临界萃取法、酶法等。其中，酶法提取应用较多的是纤维素酶，纤维素酶是一组复合酶，大部分植物的细胞壁由纤维素构成，植物的有效成分往往包裹在细胞壁内，纤维素酶能够水解纤维素，使植物细胞壁破坏，充分释放细胞内含物，有利于对有效成分的提取，进而提高物料的利用率[16-19]。本研究采用Box-Behnken试验优化纤维素酶酶解提取山葡萄渣白藜芦醇工艺，为进一步开发利用山葡萄渣白藜芦醇奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山葡萄购自蚌埠市农贸市场，除去果肉后得到葡萄皮和葡萄籽混合物，经干燥后过60目筛。

白藜芦醇标准品(纯度98%) 山东泓捷生物科技有限公司；纤维素酶(酶活力为40000U/g) 杰诺生物酶有限公司；无水乙醇、甲醇、丙酮均为分析纯。

1.2 仪器与设备

752N紫外分光光度计、FA-N/FC电子分析天平、GL-12B高速冷冻离心机 上海精密科学仪器有限公司；B220型恒温水浴锅、RE-2000型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；FW80型高速万能粉碎机 北京市永光明医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 白藜芦醇的提取[20]

准确称取山葡萄渣粉末1.0g，放入150mL锥形瓶中，加入适量水和纤维素酶进行酶解，酶解后加入一定量的体积分数80%乙醇溶液和80%的丙酮溶液(体积比1:1)，提取一段时间后，将提取液离心，上清液经浓缩、蒸发得白藜芦醇样品。

1.3.2 白藜芦醇含量的测定[21]

称取适量白藜芦醇置于容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得白藜芦醇对照品储备液。精密吸取对照品储备液，配制成一系列不同质量浓度的标准溶液，于波长306nm处测定吸光度，绘制标准曲线，以对照品白藜芦醇含量为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归线性方程y=0.6942x-0.0315，R2=0.9942，线性范围为0.3～1.59mg/g。由线性回归方程可知，白藜芦醇含量与吸光度值呈正相关。准确称取一定量样品于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品液，于波长306nm处测定吸光度，由线性回归方程得出白藜芦醇的含量。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 酶添加量对白藜芦醇提取效果的影响

取适量粉末，分别添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/g的纤维素酶，在55℃、pH5条件下，酶解1.5h。酶解后加入一定量的乙醇溶液，提取一段时间后，将提取液离心，经浓缩、蒸发得白藜芦醇样品。用甲醇溶液溶解样品并稀释，摇匀，于波长306nm处测定吸光度。每个实验重复3次，考察酶添加量对白藜芦醇提取效果的影响。

1.3.3.2 酶解pH值对白藜芦醇提取效果的影响

在酶添加量1.5mg/g、55℃条件下，pH3.5～6.0范围内，酶解1.5h，考察pH值对白藜芦醇提取效果的影响。1.3.3.3 酶解时间对白藜芦醇提取效果的影响

在酶添加1.5mg/g、55℃、pH5条件下，酶解0.5～3h，考察酶解时间对白藜芦醇提取效果的影响。1.3.3.4 酶解温度对白藜芦醇提取效果的影响

在酶添加1.5mg/g、pH5条件下，40～65℃酶解1.5h，考察温度对白藜芦醇提取效果的影响。

1.3.4 Box-Behnken试验设计

采用Box-Behnken设计，选取酶添加量、酶解时间和酶解温度为自变量，以白藜芦醇含量Y为响应值，根据单因素试验结果，进行3因素3水平的响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶添加量对白藜芦醇提取效果的影响

由图1可知，在酶添加量为0.5～1.5mg/g时，随着酶添加量的增加，白藜芦醇含量随酶添加量增加逐渐增大；当酶添加量为1.5mg/g时，白藜芦醇含量达到最大；此后，继续增加酶添加量，白藜芦醇含量反而有下降的趋势。根据分子络合学说，由于底物与酶分子反应过程中，存在某个平衡点，当酶量较低时，酶分子与底物可以充分结合；当继续增加酶量，底物结合酶的程度会加大，当反应达到饱和后，酶活性趋于稳定。因此，并不是酶量越大越利于酶解效果的发挥，对于一定的底物来说，存在一个最佳的酶用量。

图1 酶添加量对白藜芦醇提取效果的影响Fig.1 Effect of enzyme/substrate ratio on resveratrol yield

2.1.2 酶解pH值对白藜芦醇提取效果的影响

图2 酶解pH值对白藜芦醇提取效果的影响Fig.2 Effect of hydrolysis pH on resveratrol yield

由图2可知，随着pH值的增大，白藜芦醇的含量先呈增加的趋势；当pH值达到5时，白藜芦醇含量达到最大；此后，随着pH值的增大，白藜芦醇含量下降。因此确定酶解较佳pH值为5。

2.1.3 酶解时间对白藜芦醇提取效果的影响

由图3可知，反应开始时，随着酶解时间的延长，白藜芦醇的含量逐渐增大；当酶解1.5h后，再延长酶解时间，白藜芦醇含量逐渐减小。原因很可能是由于酶与底物的充分反应需要一定的时间，时间很短时，酶分子与底物结合程度较低，酶解效果不理想，随着反应时间的延长，酶与底物充分结合，此时，酶解效果最佳。如果再延长反应时间，酶解产物白藜芦醇的量会慢慢增加，加速了逆反应的进行，酶反应速率会有所下降，从而导致提取效率下降。因此，确定较适宜酶解时间为1.5h。

图3 酶解时间对白藜芦醇提取效果的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on resveratrol yield

2.1.4 酶解温度对白藜芦醇提取效果的影响

图4 酶解温度对白藜芦醇提取效果的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on resveratrol yield

由图4可知，在酶解温度为40～55℃时，白藜芦醇含量随酶解温度升高逐渐增加，酶解温度在55℃时白藜芦醇的含量最高；55℃以后，随着酶解温度升高，白藜芦醇含量增加不明显。这是由于在酶解反应中，温度与酶稳定性及反应速率有关。当温度升高时，反应速率加快，这样就利于酶解的进行，而当温度过高时，可能会使部分或全部酶分子产生变性甚至失活，导致酶分子与底物结合效率下降，使反应速率降低。

2.2 响应面设计方案及结果

在单因素试验的基础上，选取酶添加量(X1)、酶解时间(X2)和酶解温度(X3)为自变量，以白藜芦醇含量(Y)为响应值进行响应面分析。试验设计及结果如表1所示。采用SAS软件进行回归分析，得到二次方程模型为：

由表2可知，模型显著(P＜0.0001)，并且失拟项不显著(P＝0.063866＞0.05)，R2＝0.9988表明此模型能解释99.88%响应变化，回归方程拟合程度良好，因此此模型可以真实地拟合和预测实际情况。从回归方程系数显著性检验可知：一次项X1，二次项X12、X22和X32极显著，X2和X3不显著，交互项X1X2、X1X3和X2X3不显著。因素X1、X2及X3的P值分别为0.0001、0.05412及0.229975，表明酶添加量影响极显著，酶解时间和酶解温度影响不显著，3个因素对白藜芦醇提取效果影响的主次顺序依次为酶添加量＞酶解时间＞酶解温度。

表1 Box-Behnken试验设计及结果Table1 Box-Behnken experimental design and results

表2 方差分析表Table2 Analysis of variance for the fitted regression model

2.3 各因素及交互作用对白藜芦醇提取效果的影响

由图5a可知，当酶解温度为55℃时，酶添加量一定，当酶添加量较低时，白藜芦醇含量随酶解时间的增加得缓慢，当酶添加量达到一定值时，随酶解时间的延长，白藜芦醇含量增加得较快，当酶解时间继续延长，白藜芦醇含量缓慢降低。酶解时间一定，随着酶添加量的增加，白藜芦醇含量增加显著，当酶添加量继续增加白藜芦醇含量反而会有所下降。分析图5可以发现，当酶添加量恒定在1.0～1.5mg/g范围内，酶解时间在1.4～1.6h范围内，白藜芦醇含量逐渐增加并达到极大值。

由图5b可知，酶添加量不变，随着酶解温度增加，白藜芦醇含量先增加后减少。当酶解温度在52～58℃范围时，白藜芦醇含量较高。酶解温度恒定，酶添加量在1.0～1.5mg/g范围内，白藜芦醇含量先逐渐增加，达到极大值，随后逐渐下降。

由图5c可知，酶解时间不变，酶解温度对白藜芦醇含量影响的等高线较稀疏，总体呈先增后减的趋势。酶解温度恒定，酶解时间对白藜芦醇含量影响的等高线较稠密，白藜芦醇含量先逐渐增加，达到极大值后逐渐下降。白藜芦醇含量极大值在酶解时间1.5～1.6h，酶解温度54～58℃之间。

图5 各两因素交互作用对白藜芦醇提取效果影响的响应面及等高线图Fig.5 Response surface plots and contour plots showing the effects of hydrolysis conditions on resveratrol yield

2.4 纤维素酶酶解处理提取山葡萄渣白藜芦醇最佳工艺参数的确定及模型验证

根据回归方程，经SAS软件分析，得出山葡萄渣白藜芦醇提取最佳工艺参数为酶添加量1.30mg/g、酶解时间1.48h、酶解温度55.49℃，得到白藜芦醇含量为0.753mg/g。为验证模型的可靠性，在该优化条件下进行3 组重复验证实验，验证实验得到的白藜芦醇含量平均值为0.746mg/g，平均误差为1.56%，小于5%，实验值与理论值基本吻合，说明该模型真实可靠，能较好地预测山葡萄渣白藜芦醇提取效果。与优化前提取得到的白藜芦醇含量(0.648mg/g)相比，是优化前提取得到的白藜芦醇含量的1.15倍。

3 结 论

3.1 采用Box-Behnken试验设计，建立白藜芦醇含量与酶添加量、酶解时间和酶解温度的二次多项式多元回归模型。结合试验，通过响应面分析可知，酶添加量对白藜芦醇提取效果影响最大，其次是酶解时间，酶解温度则最小。

3.2 得到纤维素酶酶解处理提取山葡萄渣白藜芦醇的最佳工艺参数为酶添加量1.30mg/g、酶解时间1.48h、酶解温度55.49℃，在此优化条件下，经验证实验，白藜芦醇含量为0.746mg/g，平均误差为1.56%，小于5%，实验值与理论值基本吻合，说明该模型真实可靠。与优化前提取得到的白藜芦醇含量(0.648mg/g)相比，是优化前提取得到的白藜芦醇含量的1.15倍。这说明Box-Behnken试验设计能充分发挥纤维素酶酶解作用，有效提高山葡萄渣白藜芦醇提取效率。

[1] 韩晶晶, 刘炜, 毕玉平. 白藜芦醇的研究进展[J]. 生物工程学报, 2008, 24(11): 1851-1859.

[2] 张初署, 杨庆利, 潘丽娟, 等. 白藜芦醇的提取及分离纯化研究进展[J]. 食品工业科技, 2008, 29(8): 289-291.

[3] LANGCAKE P, PRYCE R. The production of resveratrol by Vitis vinifera and other members of the vitaccae as a response to infection or injury[J]. Physio Plant Path, 1976, 9(11): 77-86.

[4] JEANDET P, BESSIS R, MAUME B F, et al. Effect of enological practices on the resveratrol isomer content of wine[J]. J Agric Food Chem, 1995, 43(2): 316-3l9.

[5] KIMURA Y, OKUDA H. ResveratroI isolated from polygonum cuspidatum root prevents tumor growth and metastasis to lung and tumor-induced neovascularization in Lewis lung carcinoma-bearing mice[J]. J Nutr, 2001, 131: 1844-1849.

[6] JANG M, CAI L, UDEANI G O, et a1. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes[J]. Science, 1997, 275(5297): 2l8-220.

[7] OPIPARI AWJ. Resveratrol-induced autophagocytosis in ovarian cancer cells[J]. Cancer Res, 2004, 64(2): 696-703.

[8] AGGARWAL B, BHARDWAJ A. Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical studies[J]. Anticancer Res, 2004, 24(5): 2783-2840.

[9] ALKHALAF M. Resveratrol-induced growth inhibition in MDAMB-231 breast cancer cells is associated with mitogen-activated protein kinase signaling and protein translation[J]. Eur J Cancer Prev, 2007, 16(4): 334-341.

[10] LEVI F, PASCHE C. Resveratrol and breast cancer risk[J]. Eur J Cancer Prev, 2005, 14(2): l39-142.

[11] BEATA O, BARBARA W. Resveratrol, a phenolic antioxidant with effects on blood platelet functions[J]. Platelets, 2005, 16(5): 251-260.

[12] 张干伟, 孙素玲, 汤坚. 花生根中白藜芦醇的醇提工艺及清除自由基研究[J]. 食品科技, 2008, 33(2): 153-155.

[13] GUISO M, MARRA C. A new efficient resveratrol synthesis[J]. Tetrahedron Lett, 2002, 43(4): 597-598.

[14] PASCNAL＆MARTI M C, SALVADOR A, CHAFER A, et al. Supercritical fluid extraction of resveratrol from grape skin of vivis inifera and determination by HPLC[J]. Talanta, 2001, 54(4): 735-740.

[15] EDER R, WENDELIN S, VRHOVSEK U. Resveratrol contents of grapes and red wines in dependency on vintage year and harvest date[J]. Mitteilungen Klostemeuburg, 2001, 51(2/3): 64-78.

[16] 李延华, 王伟君, 张兰威, 等. 白藜芦醇的研究现状及应用前景[J].中国酿造, 2008, 184(7): 10-12.

[17] 陈秀霞, 陈由强, 陈如凯. 白藜芦醇研究进展[J]. 福建林业科技, 2003, 30(4): 84-88.

[18] 李胜华, 伍贤进. 超声波法提取虎杖中白藜芦醇的优化工艺研究[J].食品工业科技, 2008, 29(7): 162-164.

[19] 李梦青, 聂媛, 张洁, 等. 酶解法提取虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素[J]. 精细化工, 2008, 25(5): 467-470.

[20] 刘树兴, 程丽英, 陈志亮, 等. 白藜芦醇提取工艺的研究[J]. 食品与发酵工业, 2004, 30(12): 145-147.

[21] 郑湘娟, 余淑娴, 徐晓芳, 等. 紫外分光光度法测定虎杖中自藜芦醇的含量[J]. 时珍国医国药, 2008, 19(8): 1881-1882.

Response Surface Methodology for the Optimization of Enzymatic Extraction of Resveratrol Grape Pomace with Cellulase

SHI Ya-zhong，FANG Jiao-long，QIAN Shi-quan，WU Ya-hua，LI Shan-ju，XU Hui
(Department of Bioengineering and Food, Bengbu College, Bengbu 233030, China)

The extraction of resveratrol from grape pomace by cellulase hydrolysis was optimized using response surface methodology. The extraction yield of resveratrol was extremely significantly influenced by enzyme dosage but not significantly impacted by time or temperature. The optimum conditions for enzymatic extraction of resveratrol from grape pomace were found to be hydrolysis at 55.49 ℃ for 1.48 h with an enzyme/substrate ratio of 1.30 mg/g. The extraction yield of resveratrol under these conditions was 0.746 mg/g, which was 1.15-fold higher than before optimization.

resveratrol；cellulase hydrolysis；response surface methodology

TS255；S663

A

1002-6630(2013)04-0075-05

2011-11-16

安徽省高等学校省级食品科学与工程特色专业建设点项目(20101091)；安徽省食品科学与工程教学团队项目(20101094)；蚌埠学院自然科学研究项目(2010ZR14)；蚌埠学院优秀人才资助项目(院字[2009]107号)

石亚中(1979—)，男，讲师，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：stoney2008@yahoo.cn