6种海洋微藻β-葡聚糖的累积特征及其免疫活性分析

田 甜，周成旭*，刘宝宁，陈海敏，严小军

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 315211)

6种海洋微藻β-葡聚糖的累积特征及其免疫活性分析

田 甜，周成旭*，刘宝宁，陈海敏，严小军

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 315211)

跟踪检测6种海洋微藻在生长过程中单位细胞β-葡聚糖的含量变化，分析其累积时期、累积速率以及提取制备的得率和纯度，并对几种微藻来源的β-葡聚糖进行免疫活性检测。结果表明：β-葡聚糖在微藻种群增殖的平台期累积量最大，不同种类的微藻细胞累积β-葡聚糖能力差异较大。假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)具有较大的累积速率、提取制备得率以及较大的免疫活性。6种海洋微藻来源的β-葡聚糖都显示比酵母来源的β-葡聚糖免疫活性高。

海洋微藻；β-葡聚糖；累积效率；提取率；免疫活性

葡聚糖又称为右旋糖酐，广泛分布在细菌、真菌、高等植物体内，有α-葡聚糖和β-葡聚糖两种，α-葡聚糖一般没有生物活性，多数具有明显生物学活性的葡聚糖都是β-葡聚糖[1]。不同来源的β-葡聚糖，其结构和生物活性都存在差异，真菌提取的如酵母β-葡聚糖，主链由1,3-β糖苷键连接，带有由1,6-β糖苷键连接的分支，具有抗肿瘤活性；高等植物如燕麦β-葡聚糖，不仅带有1,3-β和1,6-β糖苷键，还存在1,4-β糖苷键连接的分子内连接[2]，具有降低总胆固醇的作用[3]。即使是同种来源的β-葡聚糖，也可能同时具有单螺旋、三螺旋或随机螺旋等立体构象[4]，从而表现多种生物活性，如防护系统增强剂(HDP)[5]、抗肿瘤[6]、抗感染[7]和免疫调节功能。β-葡聚糖既可作为膳食纤维来源，又是一种优质的保健食品添加剂，已被正式列入国家资源产品[8]。

海洋微藻是海洋生态系统中的最主要初级生产者，也是海洋生物资源的重要组成部分。海洋微藻生长速度快，单位面积产量大，相对于高等植物，可以更有效地利用阳光、水和二氧化碳等无机物合成有机物[9]，而且在生产过程中不占用耕地，是未来海洋资源开发的重要对象。糖类是海洋微藻重要的代谢产物，海洋微藻多糖除了具有传统的工业价值外，还具有多种生物活性及药用功能[10]，如增强机体免疫、抗病毒作用、抗恶性肿瘤、抗炎症[11-15]。已有分析显示，来源于微型藻类牟氏角毛藻的β-葡聚糖较市售产品的免疫活性高[16]。综上所述，从微藻中提取高活性β-葡聚糖有重要科学意义。

本实验以微型藻类生产β-葡聚糖为目标，在实验研究的基础上，对几种可以快速增殖的海产微型藻类β-葡聚糖的产生规律、制备产率和产量以及生物活性等进行分析，为微藻来源β-葡聚糖的选种、采收时机选择等方面的研究和生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

藻种及其培养：选取6种海产微藻，均为宁波大学微藻种质库保存种质。其中硅藻4种：中肋骨条藻(Skeletonema costatum (Greville) Cleve)、角毛藻(Chaetoceros debilis Cleve)、假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana Hasle & Heimdal)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum Bahl.)。金藻2种：等鞭金藻(Isochrysis galbana Parke)和一种颗石藻(Pleurochrysis sp.)。各种微藻在相同的培养条件下，用f/2培养液悬浮培养。培养环境温度20℃、光照度2500lx(白天:黑夜=12:12)，每天摇瓶2次。每种藻设3个平行组，培养体积800mL，起始培养密度为1.9×105～2.1×105cells/mL。

1.2 试剂与仪器

β-葡聚糖标准品(纯度＞95%) 武汉百特纯大分子科技有限公司；玻璃纤维滤纸 英国Whatman公司；小鼠肿瘤坏死因子-α ELISA试剂盒 武汉博士德生物有限公司；小鼠巨噬细胞(Raw 246.7) 武汉中国典型培养物保藏中心；刚果红 上海远航试剂厂；Sephadex G-50美国Pharmacia公司；其余试剂均为为国产分析纯。

GXZ-128A智能光照培养箱 宁波江南仪器有限公司；酶标仪 德国Thermo公司；UV-7540紫外-可见光分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；TS100倒置生物显微镜 日本尼康公司；超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；BUCHI R-210/215旋转蒸发仪上海万捷科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-葡聚糖在种群生长过程中变化规律的研究

1.3.1.1 微藻种群生长过程跟踪

以微藻悬浮液光密度值表征种群生长状态，培养微藻至平台期，将藻液2倍稀释成4个梯度，取200μL各梯度藻液至96孔板，于630nm波长测吸光度；同时用血球计数板计数对应藻液细胞密度，设3个平行，绘制藻液吸光度和对应细胞数的关系曲线。样品检测时，取200μL藻液至96孔板，于630nm波长处测吸光度。比照吸光度与细胞数关系曲线，计算细胞数。隔天取样，培养至20d。

1.3.1.2 种群生长过程中细胞内β-葡聚糖含量测定

参考Granum等[17]的方法，制作葡萄糖吸光度标准曲线。样品测量时将藻液摇匀，吸取10mL藻液用玻璃纤维滤纸(Whatman CF/C)过滤，收集滤膜上的藻细胞。往藻细胞中加入5mL 0.05mol/L H2SO4，于60℃水浴加热30min，再用玻璃纤维滤纸过滤，收集过滤液。取1mL滤液，于485nm波长处测吸光度，比照标准曲线计算相应的β-葡聚糖含量。隔天取样，培养至20d。

1.3.2 β-葡聚糖制备及其得率分析

1.3.2.1 β-葡聚糖的提取制备

按上述条件培养微藻至平台期，4℃、4800r/min离心10min，收集藻细胞，冷冻干燥收集干藻粉。称取一定量的各种藻粉，按照Hirokawa等[18]的方法提取葡聚糖，得到淡黄色蓬松纤维状葡聚糖粗糖。

参考何贶等[19]的方法：取粗糖溶解后进行Sephadex G-50柱层析纯化，以纯水洗脱，控制流速大约0.25mL/min，每管收集2.5mL分部收集。每管吸取少量收集液用苯酚-硫酸法检测，按照管号对光密度绘制洗脱曲线，将最大峰处的洗脱液合并，旋转蒸发，冷冻干燥，得到淡黄色粉末状葡聚糖纯糖。

1.3.2.2 β-葡聚糖的含量测定

刚果红法测β-葡聚糖含量：刚果红与β-葡聚糖反应具有高度专一性，形成有色物质，当反应条件一致时，溶液中β-葡聚糖含量在一定范围内吸光度变化与β-葡聚糖浓度成正比[20]，本研究以刚果红法检测粗糖样品中β-葡聚糖纯度。参考张娟等[21]的方法制作葡聚糖光密度标准曲线，样品检测时称取0.005g样品，加少量去离子水，70℃水浴助溶，再加去离子水至体积为10mL配成500μg/mL的样品液，冰箱储存备用。测量时，取80μL的样品液，添加去离子水至体积为1mL，配成40μg/mL葡聚糖溶液，再加入2mL刚果红溶液，20℃水浴加热30min后取1mL于545nm波长处测吸光度，比照标准曲线计算样品液β-葡聚糖含量。

1.3.3 β-葡聚糖免疫活性检测

1.3.3.1 细胞培养

取小鼠巨噬细胞Raw 264.7细胞液1mL/孔于24孔板，37℃培养24h，控制细胞数为2×105cells/mL，再依次加入5、10、20μL 10mg/mL β-葡聚糖溶液，形成50、100、200μg/mL的质量浓度梯度，留一个孔的细胞液不加葡聚糖作空白对照，培养24h后取出备用。

1.3.3.2 免疫活性检测

收集细胞液，4℃、5000r/min离心5min，取上清液，按照小鼠肿瘤坏死因子-α ELISA试剂盒说明书操作ELISA实验。每组做2个平行。

1.4 数据分析

实验数据采用x±s表示。

图1 6种海产微藻培养增殖过程中细胞数和单位细胞β-葡聚糖含量变化特征Fig.1 Population growth and cellular β-glucan content variations in different species of marine microalgae

2 结果与分析

2.1 微藻培养过程中β-葡聚糖含量变化特征

由图1可知，比较6种海洋微藻在种群生长过程中单位细胞β-葡聚糖含量变化趋势，受初始接种微藻状态的影响，种群生长初期即在新的营养条件下都表现为胞内β-葡聚糖降低，指数增长期中出现β-葡聚糖的最低值，以后各藻细胞中β-葡聚糖逐渐累积，到平台期后期或衰亡期β-葡聚糖累积得最多。在进入平台后期(或衰亡期)后，三角褐指藻、假微型海链藻和等鞭金藻细胞内β-葡聚糖含量持续增加，中肋骨条藻、角毛藻和颗石藻单位细胞β-葡聚糖含量的增加则趋于平缓。显示了不同种类对β-葡聚糖的代谢利用特征上的差异。

表1 海产微藻单位细胞β-葡聚糖含量最小、最大值及累积倍增效率Table1 Maximum and minimum contents and cumulative doubling efficiency of β-glucans from different species of marine microalgae at the same culture

进一步分析各种增殖培养过程中β-葡聚糖从最小值至最大值的累积效率。从表1可以看出，在相同培养条件下，不同微藻β-葡聚糖的累积量差异明显。分析微藻种群增殖过程中，单位细胞β-葡聚糖含量从最低到最高变化过程发现，假微型海链藻单位β-葡聚糖增加倍数最大，为1002.5%，增加速率最快，平均达71.61%/d，而其他微藻的增加倍率在200%～500%之间。显示假微型海链藻细胞β-葡聚糖与生长代谢关系密切，利用其生产β-葡聚糖的可调节程度高。

2.2 β-葡聚糖的得率和纯度分析

得率和纯度都能反映提取方法的提取效率。由表2可见，中肋骨条藻、三角褐指藻、角毛藻和等鞭金藻提取β-葡聚糖的得率在0.2%以上、纯度在91%以上，假微型海链藻和颗石藻提取β-葡聚糖的得率分别为0.346%和0.329%，纯度分别为93.99%和94.21%，相对于其他微藻的得率和纯度都较高。总体来说，6种海产藻β-葡聚糖提取得率、纯度跟平均值比较差距相对不大，可能是因为提取方法一样。关于β-葡聚糖提取的方法较多，主要的提取方法有酸碱法[22]、酶法[23]等，比较Wood等[24]温和碱法提取燕麦β-葡聚糖的得率达0.7%，纯度低于90%，本提取方法提取β-葡聚糖的纯度较高，提取得率却比较低，今后需要改进提取条件进一步提高得率。

表2 海产微藻β-葡聚糖提取效率Table2 Extraction efficiency ofβ-glucans from different species of marine microalgae

2.3 β-葡聚糖免疫活性检测

肿瘤坏死因子(TNF-α)是目前发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子，它可以调节肿瘤细胞的生长。很多细胞都可以合成TNF-α，包括各种免疫细胞，如单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等。将不同浓度的海洋微藻β-葡聚糖作用于小鼠单核巨噬细胞(RAW246.7)，通过ELISA实验观察β-葡聚糖诱导TNF-α生成量的变化，结果如图2所示。

图2 6种海洋微藻的生成量Fig.2 Production of TNF-α induced by β-glucans at different concentrations from different species of marine microalgaeβ-葡聚糖在不同浓度下诱导TNF-α

将6种海产微藻β-葡聚糖作用于小鼠巨噬细胞均诱导TNF-α生成量的增加，由此可以推测海产微藻β-葡聚糖有具有激活巨噬细胞、促进细胞因子合成和抗肿瘤等生物学活性[25]。比较不同质量浓度β-葡聚糖对Raw264.7细胞生成TNF-α量的影响，不同微藻来源的β-葡聚糖有质量浓度相关的不同效应。对中肋骨条藻和颗石藻来源而言，TNF-α生成量随β-葡聚糖质量浓度增加而增加，在200μg/mL时TNF-α生成量最大；角毛藻和假微型海链藻的β-葡聚糖质量浓度在100μg/mL时TNF-α生成量达到饱和，β-葡聚糖质量浓度为200μg/mL TNF-α生成量跟100μg/mL没有显著差别；三角褐脂藻和等鞭金藻的β-葡聚糖质量浓度为100μg/mL时TNF-α生成量最大，当质量浓度为200μg/mL TNF-α生成量反而下降，显示了免疫抑制的特点。

由图3可知，比较相同质量浓度(100μg/mL)的几种海洋微藻β-葡聚糖诱导TNF-α增加量，三角褐指藻来源的β-葡聚糖活性最大，角毛藻来源的β-葡聚糖活性最小，其他微藻来源的β-葡聚糖诱导TNF-α生成量在600～700pg/mL。与陈璐等[26]100μg/mL酵母β-葡聚糖诱导TNF-α最大增加量为232.18pg/mL相比，相同浓度海洋微藻β-葡聚糖诱导TNF-α增加量是酵母β-葡聚糖的2.5～3.2倍，所以海洋微藻来源的β-葡聚糖抗肿瘤活性高于酵母β-葡聚糖。

增加量的比较Fig.3 Comparison of TNF-α production induced by 100 μg/mL β-glucans from different origins图3 100μg/mL不同来源的β-葡聚糖诱导TNF-α

3 结 论

3.1 海产微藻细胞的β-葡聚糖在种群增殖过程中都发生变化，在平台后期达到最大累积。

3.2 由于海洋微藻生长及代谢的差异，使不同海洋微藻在种群生长过程中β-葡聚糖的累积特征和累积效率有所差别，并且其免疫活性也有所不同。但相同质量浓度下，海产微藻来源β-葡聚糖的免疫活性均比酵母来源的β-葡聚糖活性高。

3.3 假微型海链藻β-葡聚糖的累积速率和提取效率明显高于其他海洋微藻；三角褐指藻提取的β-葡聚糖免疫活性最高，这两种藻都可能成为今后β-葡聚糖重要的微藻来源。

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Accumulation Features and Immuno-stimulative Effects of β-Glucans from Six Species of Marine Microalgae

TIAN Tian，ZHOU Cheng-xu*，LIU Bao-ning，CHEN Hai-min，YAN Xiao-jun
(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The accumulation features of microalgal β-glucans, including accumulation phase and rate, have been characterized by monitoring the content of β-glucans from six marine microalgae during their growth cycles. The extraction and immuno-stimulative effects of β-glucans were also studied. The results indicated that the content of cellular β-glucans reached the maximum level at stationary phase for all microalgae, however, with large variation depending on species. Among six microalgae, Thalassiosira pseudonana showed outstanding features for its β-glucans with high accumulation rate, isolation yield, and significant immuno-stimulative effects. Therefore, the immuno-stimulative effects of β-glucans were higher from microalgae than that from yeast.

marine microalgae；β-glucans；accumulative rate；extraction rate；immune activity

Q945.79

A

1002-6630(2013)03-0188-05

2012-10-20

教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目(IRT0734)；国家自然科学基金项目(31172448)；浙江省重点基金项目(Z3100565)；浙江省自然科学基金项目(LY12D06001)；海洋可再生能源专项资金项目(GHME2001SW02)；国家公益性行业(海洋)科研专项(201105009)

田甜(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为微型藻类生理生态学。E-mail：liazajoy@163.com

*通信作者：周成旭(1968—)，女，副研究员，硕士，研究方向为海洋微型藻类的基础研究及应用。E-mail：zhouchengxu@nbu.edu.cn