嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混菌生物膜发酵特性及其抗逆性

玛依诺·木图拉，王 坤，陈晓红，姜 梅，李 伟，董明盛,*

(1.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；2.新疆师范大学生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混菌生物膜发酵特性及其抗逆性

玛依诺·木图拉1,2，王 坤1，陈晓红1，姜 梅1，李 伟1，董明盛1,*

(1.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；2.新疆师范大学生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

利用扫描电子显微镜对嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)在不锈钢网布及椰果粒表面形成的混菌生物膜进行观察，并对不锈钢网布表面混菌生物膜发酵特性及其抗逆性进行研究。结果表明：Streptococcus thermophilus和Lactobacillus bulgaricus可在两种载体表面形成典型的混菌生物膜结构，且不锈钢网布表面混菌生物膜的发酵液菌体密度变化曲线与细菌S型生长曲线相似，但在停滞期和对数期不明显，发酵液pH值呈现先下降后趋于平稳的趋势，终止pH值接近4.0；此外，不锈钢网布表面混菌生物膜比游离乳酸菌具有更强的抗性，并且可在15d内稳定地释放较高浓度的游离乳酸菌。

乳酸菌；生物膜；发酵

细菌生物膜(biofilm)是一种附着于细菌体表或界面由细菌群体和包裹菌体的水合性基质组成的聚合体[1-2]，生物膜成熟后可以释放游离菌体。与普通游离细菌相比，生物膜细菌和生物膜释放细菌具有较强的抗逆性。由于生物膜细菌在生理、代谢、对底物的降解或利用和对环境的抵抗能力等方面具有独特的性质[3-5]，生物膜的研究近年来备受重视。

目前，细菌生物膜已在多个领域被广泛研究和应用，如环境修复工程(水体脱氮[6]、生物修复、吸附重金属[7])和能源产业(氢气制造[8])。然而，关于乳酸菌生物膜方面的研究和应用还相对较少，Speranza等[9]研究利用乳酸菌生物膜来控制软质干酪中李斯特氏菌的生长，Rangaswamy等[10]研究过利用德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii)生物膜来连续生产乳酸。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是益生菌典型代表，广泛应用于工业生产，利用其生物膜或生物膜释放菌体进行生产，既可以获取优良菌体又可以节约发酵剂，提高经济效益。本实验以保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的混菌生物膜为研究对象，对其结构、发酵特性、抗逆性及其作为连续接种源的可能性进行研究，以期为乳酸菌混菌生物膜在未来的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

不锈钢网布(300目) 河北省安平县天瑞金属制品厂；椰果粒 福建省泉州喜多多食品有限公司。载体规格见表1。载体使用前先在95%乙醇中浸泡30min，然后再用无菌生理盐水浸泡清洗数次以除去残留乙醇。

表1 载体规格Table1 Specification of carriers

1.2 菌种、培养基与试剂

嗜热链球菌(S. thermophilus)、保加利亚乳杆菌(L. bulgaricus)为南京农业大学食品微生物实验室自行分离和保存。

MRS液体培养基：参照文献[11]方法配制。

2.5 %戊二醛溶液[11]；生理盐水；LIVE/DEAD Baclight荧光染色试剂盒 美国Molecular Probes公司。

1.3 仪器与设备

UP3200H超声波清洗器 熊猫集团南京电子计量有限公司；S-3000N扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；Leica TCS SP2激光扫描共聚焦显微镜 德国Leica公司；GJB发酵控制系统 江苏大学生物工程研究所。

1.4 方法

1.4.1 混菌生物膜的培养

采用置片法[12]培养混菌生物膜：将处理后的不锈钢网布和椰果粒置于无菌MRS液体培养基中，按酸乳生产接种时1:1(V/V)的比例，以1%接种量接种S. thermophilus和L. bulgaricus，37℃静置培养，每24h更换一次新鲜培养基，连续培养7d，使其在载体表面形成成熟生物膜。

1.4.2 混菌生物膜的观察

将样品用2.5%戊二醛溶液固定，采用扫描电子显微镜(SEM)观察。

1.4.3 混菌生物膜的发酵实验

首先向2.5L小型发酵罐中注入2L MRS液体培养基，然后接入S.thermophilus和L.bulgaricus(接菌比例、接种量同上)，37℃静置培养2d后每24h更换一次新鲜培养基，在转速105r/min、37℃条件下继续培养5d以形成成熟生物膜。生物膜形成后先用2.5L生理盐水连续清洗发酵罐2次，再加入2L MRS新鲜液体培养基开始发酵：24h之前，每2h取一次样，之后每4h取一次样。对样品进行pH值和菌体密度的测定。

1.4.3.1 发酵液pH值的测定

发酵液pH值由发酵控制系统配备pH探头直接测得。

1.4.3.2 发酵液菌体密度的测定

菌体密度采用平板计数法测定，根据稀释倍数和涂布取样量即可换算出样品的含菌量[13]，以每毫升样品的菌落数(CFU/mL)表示。

1.4.4 不锈钢网表面混菌生物膜的抗性研究

1.4.4.1 混菌生物膜抗性实验

首先将3片附有成熟混菌生物膜的不锈钢网布用无菌生理盐水清洗3次，然后分别装入3个盛有10mL 50℃无菌MRS液体培养基的三角瓶中水浴5min，结束后立即取出网布置入另一相同三角瓶中，室温超声波(200W)处理3min[14]，取三角瓶中液体计菌数。对照为37℃条件下相同处理。pH 2.0条件下的抗性实验同上。

1.4.4.2 悬浮液混菌抗性实验

取37℃条件下培养18h的游离混菌菌液10mL离心5min(6000r/min、4℃)，然后弃去上清向菌体沉淀中加入10mL 50℃无菌MRS液体培养基，迅速取出5mL移入10mL无菌离心管并混匀取样0.5mL计数，其余部分50℃水浴5min后计数。pH 2.0条件下的抗性实验同上。抗性强弱依据处理后菌体存活率大小确定。

1.4.5 乳酸菌混菌生物膜作为连续接种源的研究

待搅拌桨上形成成熟的混菌生物膜后，对生物膜释放游离菌体的能力进行测定。具体方法如下：排出发酵液后，首先用无菌生理盐水将发酵罐连续冲洗3次，以洗掉表面附着菌体。然后向发酵罐中注入2L无菌生理盐水(105r/min，37℃)，3min后排出液体并取样计数。此步骤重复进行5次。计数完毕，重新向发酵罐中注入2L新鲜MRS液体培养基，培养24h(105r/min，37℃)。此即为一个循环。实验共15个循环。

2 结果与分析

图1 椰果粒(a)和不锈钢网布(b)载体上混菌生物膜电子显微镜图Fig.1 Images of mixed-species biofilm on different carriers examined by SEM

2.1 混菌生物膜的电镜观察结果由图1可知，S. thermophilus和L. bulgaricus在两种载体表面上可以形成典型的混菌生物膜，菌体与菌体之间紧密排列，共同粘联在载体表面。同时，生物膜的典型结构——生物膜孔道(图中空隙部分，用于细胞之间营养物质的传送和代谢废物的排出)也清晰可见。至此可知S. thermophilus和L. bulgaricus可以在不锈钢网布和椰果粒表面形成典型的混菌生物膜。

2.2 混菌生物膜发酵液菌体密度的变化

图2 混菌生物膜发酵液菌体密度变化曲线Fig.2 Change curve of bacterial colony number in the broth fermented by mixed-species biofilm

由图2可知，0～20h时，菌体密度增速较快，24h后，菌体密度达到最大值(超过108CFU/mL)并基本趋于平稳，而28h后有略微下降趋势。混菌生物膜发酵液菌体密度变化曲线和细菌S型生长曲线比较相似，但停滞期和对数期不明显。分析其原因，可能是因为成熟生物膜可以持续释放菌体，但释放菌体对环境的适应还需要一定时间，而一定环境的细菌容纳量是有限的，这就造成发酵液菌体密度接近最高时而大部分释放菌体尚未达到最大活力，所以停滞期和对数期不明显。

2.3 混菌生物膜发酵液pH值的变化

图3 乳酸菌混菌生物膜发酵液pH值变化曲线Fig.3 pH change curve of the broth fermented by mixed-species biofilm

由图3可知，随着时间的延长，发酵液pH值呈逐渐下降的趋势，24h后下降趋势变缓，有趋于平稳的态势，发酵液终止pH值接近4.0。这与游离保加利亚乳杆菌32h发酵液pH值差异不大(3.96)[15]，说明生物膜乳酸菌与游离乳酸菌具有相似的产酸能力。

2.4 混菌生物膜和游离菌体抗性实验结果

图4 不同条件下游离细菌与不锈钢网布表面混菌生物膜菌体存活率的比较Fig.4 Comparison of survival rates between planktonic and mixedspecies biofilm on stainless steel under different conditions

由图4可知，不锈钢网布表面混菌生物膜在50℃和pH2.0条件下处理5min 后，菌体存活率分别为72.4%和44.5%远大于混菌悬浮液菌体的26.37%和6.2%。说明混菌生物膜菌体比游离菌体具有更强的抗逆性。

2.5 乳酸菌混菌生物膜释放游离菌计数

图5 乳酸菌混菌生物膜释放游离菌数变化曲线Fig.5 Change curve of free bacteria released by mixed-species biofilm

由图5可知，在15次循环中，乳酸菌混菌生物膜每次冲洗时释放的游离菌数都在106CFU/mL或106CFU/mL以上，虽然每次循环随着冲洗次数的增加，菌体浓度有略微下降趋势，但幅度并不明显，说明乳酸菌混菌生物膜具有较高和稳定的菌体释放能力，具有作为连续接种源的潜力。

3 结 论

利用扫描电子显微镜对S. thermophilus和L. bulgaricus在不锈钢网布和椰果粒表面形成的乳酸菌混菌生物膜进行了观察，结果表明，S.thermophilus和L.bulgaricus可在不锈钢网和椰果粒表面可以形成典型的混菌生物膜，然后对不锈钢网布表面混菌生物膜的发酵特性进行了研究，发现不锈钢网布表面混菌生物膜发酵液菌体密度变化曲线类似细菌S型生长曲线，但在停滞期和对数期不明显，生物膜乳酸菌发酵液pH值呈现先下降后趋于平稳的趋势，终止pH值接近4.0，贺银凤等[16]对乳酸菌固定化工艺参数及发酵特性进行研究时固定化乳酸菌发酵牛乳pH值变化趋势与此相似。除此之外，本实验对乳酸菌混菌生物膜的抗逆性和释放菌体的能力也做了一些研究，发现乳酸菌混菌生物膜具有较高的抗性并能稳定地释放菌体，这为乳酸菌混菌生物膜在未来的应用提供了可能。

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Fermentation Performance and Resistance of Biofilm Formed by Mixed Bacterial Strains of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus

Mahinur·MUTUVULLA1,2，WANG Kun1，CHEN Xiao-hong1，JIANG Mei1，LI Wei1，DONG Ming-sheng1,*

(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. College of Life Sciences, Xinjiang Normal University, Ürümqi 830052, China)

In this study, the biofilm on coconut or stainless mesh formed by mixed bacterial strains such as Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus was observed by scanning electron microscope, and then the preliminary study on fermentation performance and resistance of the generated biofilm on stainless mesh was conducted. The results showed that S. thermophilus and L. bulgaricus could form typical mixed-species biofilm on coconut and stainless mesh, and the change curve of bacterial density from the broth fermented by mixed bacterial strains on stainless mesh was S-shaped growth curve, while the lag phase and logarithmic phase was not obvious. The pH of the broth fermented by mixed-species biofilm revealed a decrease in the early stage and then a stable level in the late stage with the final pH close to 4.0. In addition, the mixed-species biofilm had stronger resistance than free bacteria.

lactic acid bacteria；biof i lm；fermentation

TS201.3

A

1002-6630(2013)03-0169-04

2012-02-24

国家“863”计划项目(2011AA100903)；江苏省自然科学基金项目(BK2011651)；教育部博士点基金(新教师类)项目(20110097120028)；南京农业大学青年科技创新基金项目(KJ2010018)

玛依诺·木图拉(1982—)，女，硕士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail：849180636@qq.com

*通信作者：董明盛(1961—)，男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail：dongms@njau.edu.cn