SP110和VDR基因多态性与结核病的关联及其与环境因素的交互作用

向 颖，林 辉，胡代玉，刘 洁，沈 静，吴 龙，李至伟，熊鸿燕 (.第三军医大学军队流行病学教研室，重庆40008;.重庆市结核病防治所，重庆400050;.解放军785部队门诊部，四川雅安65000)

结核病的发生和转归与传统环境因素及宿主遗传因素密切相关，且这些因素之间存在复杂的交互作用，但关于两者在结核病发生中的交互作用研究报道极少。维生素D受体(VDR)基因和SP110基因均可影响结核杆菌感染免疫及产生组织学应答最主要的效应细胞巨噬细胞的功能和活性，从而影响结核分支杆菌在巨噬细胞中的存活、生长及感染后的转归等。大量流行病学研究证实 VDR 基因(TaqI、FokI)［1-3］、SP110基因(rs1135791、rs722555)SNPs多态性与结核病易感性相关［4-6］。本研究以重庆地区人群为研究对象，采用病例对照研究方法探讨SP110、VDR基因的多态性与肺结核易感性的关系及基因间、基因与传统环境间的交互作用，为进一步理解结核病病因等提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

病例组:2010年4月至2011年4月，按照《中国结核病分类法》诊断标准，从重庆市结核病防治所和沙坪坝区结核病防治中心连续收集新确诊的汉族肺结核病患者198例组成病例组，排除伴有HIV感染、糖尿病、肿瘤、慢性肺炎等其他疾病的患者。对照组:要求与病例组的年龄和性别成组匹配，从某三甲医院献血中心和体检中心同期体检的人群中选择健康的人群(胸透正常，PPD试验阴性)共195人作为对照组。

1.2 调查主要方法

1.2.1 流行病学调查 根据文献报道，选择与结核病主要相关因素进行调查，如年龄、性别、家庭收入、烟草暴露、卡介苗接种史等。采用面对面询问的方式填写调查表。

1.2.2 DNA提取 利用全血基因组提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取柠檬酸钠抗凝静脉血5基因组DNA，-30°保存备检。

1.2.3 基因多态性检测 选择与结核病联系相对稳定的VDR 基因(TaqI、FokI)和 SP110 基因(rs1135791、rs722555)作为交互作用分析位点。依据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html)信息，设计并合成PCR扩增引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，见表1。由江苏为真生物医药科技有限公司采用高分辨率溶解曲线技术(high resolution melt，HRM)进行多态性检测，并采用DNA测序进行分型确认。结合基因型分型图和DNA测序结果判断基因型。

1.2.4 统计分析方法 采用SPSS 18.0软件包进行数据管理和统计分析。分别采用单因素分析和多因素非条件logistic回归分析进行相关性和交互作用分析，以P＜0.05具有统计学显著性差异。

表1 VDR和SP110基因多态性PCR扩增引物

2 结果

2.1 研究对象及一般情况

分别收集215名肺结核病病例和对照，其中病例组198名和对照组195名完成HRM检测纳入分析，据样本含量公式估算，达到统计学最低样本量要求(180例)。2组的年龄和性别构成无统计学显著性差异(P＞0.05)。

2.2 主要环境因素与结核病相关性分析

传统环境因素与结核病相关性的单因素分析结果证实结核病患者接触史、吸烟、人居平均面积、人均年收入、居室通风、工作强度等与结核病发生有关［7］。

2.3 VDR和SP110基因多态性与结核病相关性分析

2.3.1 Hardy-Weinberg平衡分析 对照组中VDR基因(FokI、TaqI)和SP110基因(rs1135791、rs722555)多态性位点的基因型分布频率与Hardey-Weinberg平衡的理论频数之间没有显著性差异(P＞0.05)，见表2，表明所选择的对照人群符合遗传平衡状态，基因型分布均匀，可以进行下一步分析。

2.3.2 基因多态性与结核病的相关性 由表3可见，病例组与对照相比，病例组中VDR基因FokI-ff基因型的分布频率(22.2%)显著高于对照组的该基因型分布(13.3%)，P ＜0.05;以FokI-FF为参照计算OR及95%CI值均大于1。未发现TaqI基因多态性与结核病明显的相关性。

病例组与对照相比，rs722555基因型G/G、rs1135791基因型C/T的分布频率存在统计学显著性差异(P＜0.05)，且以对应的野生型为参照的OR值及OR95%CI值下限均大于1。

2.3.3 传统因素与基因的交互作用分析 选择单因素分析中与结核病相关的传统因素和基因位点进行多因素非条件logistic回归分析，以了解它们在结核病发生中的作用。由表4可见，结核病患者接触史、吸烟、FokI-ff和rs722555基因型G/G进入回归模型，OR及OR95%CI与因素单独存在时有明显差异。再将这些因素分别组合为一独立因素，再次进行多因素logistic回归分析，以判断它们间交互作用。其中同时具备FokI-ff与吸烟、结核病患者接触史的人群发生结核病的危险性明显高于这3个因素单独时的危险性。

3 讨论

研究证实结核病的发生、转归与传统环境因素(如吸烟、居住环境、接触史等)和宿主遗传易感基因(如VDR［1-3］、HLA［8］、NRAMP1［3］、SP110［4-6］等)等因素共同作用密切相关，但关于传统环境因素与易感基因在结核病发生中的交互作用研究报道较少。其中SP110基因和VDR基因分别位于2q37.1，12q13-q14，其编码产物均可调节巨噬细胞生物活性，影响结核分枝杆菌在其内的生长繁殖，而与结核病易感性相关［9-10］，这已被国内外大量流行病学研究分别证实。本研究选择文献报道与结核病联系相对稳定的VDR基因(TaqI、FokI)和SP110基因(rs1135791、rs722555)作为验证和后续交互作用分析位点，以进一步探讨基因与基因、基因与传统环境因素的交互作用。本研究的样本量符合统计学要求，同时对照组基因多态性分布符合遗传平衡状态，其结果可为进一步认识本研究地区结核病的发病机制提供科学依据。

表2 VDR、SP110基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检验

表3 VDR基因FokI、TaqI位点基因型的组间分布及关联分析

表4 环境因素和基因多态性在结核病发生中的多因素非条件logistic回归分析

VDR基因FokI-ff基因型导致VDR基因功能第1个起始密码子ATG突变为ACT，导致其结构和其翻译氨基酸增加，从而影响VDR受体活性，而与结核病易感性相关。本研究(表3)与 Singh［3］和 Merza［11］等均发现VDR FokI-ff与肺结核易感性相关。但与Sharma等［2］报道结果相左。本研究及周丹等［4］均发现重庆地区SP110 rs722555和rs1135791单核苷酸多态性和肺结核易感性存在相关，且与JeVrey等［12］分别以南非、俄罗斯、西非为研究对象的OR95%CI接近。但Xun等［13］纳入共6篇关于SP110基因多态性与结核病易感性的病例对照研究进行系统评价，结果提示SP110基因多态性与结核病易感性相关性不强。这些研究进一步提示基因多态性与结核病的相关性存在明显地区和人群差异。因此，以不同人群为研究对象开展相关研究对于阐明结核病遗传相关性有重要意义。

多因素logistic回归分析结果(表4)显示，结核病患者接触史、吸烟、FokI-ff和rs722555基因型G/G进入回归模型，其中同时具备FokI-ff与吸烟、结核病患者接触史的人群以及同时具备吸烟、FokI-ff与rs722555-G/G人群发生结核病的危险性明显高于各个因素独立时的危险性，提示基因与环境、基因间存在一定正交互作用。

由于本研究纳入研究的样本量相对较小，难以进行分层分析，在一定程度上限制了传统因素与基因、基因与基因间的交互作用判断，同时与结核病发生相关传统环境因素、易感基因众多，有待扩大样本量和选择更多易感基因、环境因素进行深入系统地研究，为阐明结核病发生、发展机制提供科学依据。

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