阿托伐他汀通过抑制RhoA活性减少非小细胞肺癌的增殖

刘 冰，阳 洁 (.广东药学院药科学院药理系，广东 广州 50006;.广西医科大学药学院药理学教研室，广西 南宁5300)

肺癌中80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinomas，NSCLCs)，早期诊断率极低，大多数患者确诊时已属晚期或发生转移，失去手术治疗的机会，需要化学药物治疗［1］。近年的研究表明，他汀类还能显著抑制前列腺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌等多种肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡［2-3］。但阿托伐他汀(ATV)能否影响NSCLCs的增殖仍不清楚。本实验旨在研究阿托伐他汀对三株NSCLCs细胞(A549细胞、H358细胞、Calu3细胞)增殖的影响及其可能的作用机制，为NSCLCs的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 阿托伐他汀，DMEM、胎牛血清，青霉素、链霉素、噻唑蓝、二甲基亚砜，RhoA siRNA、control siRNA、单克隆抗RhoA抗体、辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体、β-actin抗体，Lipofectamine 2000，RhoA特异性抑制剂 C3 transferase，增强化学发光检测试剂盒，Rho-GTP亲和力测试板。

1.1.2 NSCLCs细胞株 A549 细胞、H358 细胞、Calu3 细胞用含10%胎牛血清及0.1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中常规培养、传代。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖实验 采用改进的MTT法测定细胞增殖情况［4］。取对数生长期的 A549细胞、H358细胞、Calu3细胞，用无血清DMEM重悬后，以5×105/mL接种于96孔板，每孔100 μl，细胞培养过夜，待细胞贴壁后，用不同浓度的阿托伐他汀和RhoA siRNA、control siRNA、RhoA特异性抑制剂(RhoA inhibitor)C3 transferase处理细胞，同时设置阴性对照组(细胞不加药物处理)、空白对照组(无细胞、仅加无血清DMEM)，各组均设3个复孔，72 h后，每孔加入5 mg/mL的噻唑蓝20 μl，培养4 h后终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在波长570 nm处测量各孔的吸光值(OD)。实验重复3次。细胞的相对增殖率(%)=(OD处理组-空白对照组)/(OD阴性对照组-空白对照组)×100%。

1.2.2 siRNA转染 三株细胞常规培养至50% ～70%以上融合时进行转染。RhoA siRNA、control siRNA转染采用Lipofectamine2000转染试剂进行［5］，细胞孵育过夜后，再培养48 h。同时设置空脂质体组，每组设3个复孔，实验重复3次。用Western blotting检测RhoA的蛋白表达，观察 siRNA的干扰效果。

1.2.3 Western blotting 根据文献［6］的方法，裂解细胞、提取总蛋白并测定浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，转移到硝酸纤维素膜，在含5%脱脂奶粉的TBST中封闭30 min，单克隆抗RhoA抗体(1∶2 000)4℃孵育过夜，TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体(1∶1 000)室温孵育1 h，TBST洗膜后，用增强化学发光检测试剂盒显色，凝胶成像仪扫描并分析图像。实验重复3次。

1.2.4 RhoA 活性测定 采用 Sterpetti的方法［7］，收集细胞膜提取物25 μg，在Rho-GTP亲和力测试板上孵育45 min，再与抗体检测试剂孵育2 h，酶标仪测定发光信号，观察RhoA活性的变化，实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 ATV对NSCLCs细胞增殖的影响

与未处理组(control)相比，0.1%DMSO溶剂对照组对三株NSCLCs细胞的增殖无明显影响(P＞0.05);与DMSO溶剂对照组比较，0.1～25.0 μmol/L 的 ATV 能明显抑制三株 NSCLCs细胞增殖，且呈浓度依赖性(P＜0.05或P＜0.01)，见图1。

2.2 ATV对NSCLCs细胞RhoA活性的影响

与未处理组(control)相比，0.1%DMSO溶剂对照组对三株NSCLCs细胞的 RhoA 活性无明显影响(P ＞0.05);0.1～25.0 μmol/L的ATV处理细胞48 h后，能明显抑制A549细胞、H358细胞的 RhoA 活性，0.5～25.0 μmol/L的 ATV 能明显抑制Calu3细胞的 RhoA活性，均呈浓度依赖性(P＜0.05或P ＜0.01)，见图2A。此外，2.5 μmol/L ATV 能持续地抑制三株细胞的 RhoA活性至96 h，且均呈时间依赖性(P＜0.05或P ＜0.01)，但2.5 μmol/L ATV 在处理 Calu3 细胞细胞 48 h后才明显抑制细胞的RhoA活性，并持续抑制到96 h(P＜0.05或P ＜0.01)，见图2B。

2.3 RhoA特异性抑制剂对NSCLCs细胞增殖的影响

与未处理组(control)比较，用1 g/mL的RhoA特异性抑制剂C3 transferase预处理细胞1 h后，能使A549细胞、H358细胞、Calu3细胞的RhoA活性分别显著下降70.79%(P＜0.01)、79.60%(P ＜0.01)、77.75%(P ＜0.01)，见图3A。与未处理组(control)比较，单用 2.5 μmol/L ATV、单用 10.0 μmol/L ATV、单用1 g/mL的RhoA特异性抑制剂C3 transferase、合用1 g/mL C3 transferase+2.5 μmol/L ATV、合用 1 g/mL C3 transferase+10.0 μmol/L ATV等5个组均能明显抑制A549细胞、H358细胞、Calu3细胞增殖(P＜0.01)。但是，与单用1 g/mL的RhoA特异性抑制剂C3 transferase组比较，合用1 g/mL C3 transferase+2.5 μmol/L ATV、合用 1 g/ml C3 transferase+10.0 μmol/L ATV两个组均无显著差异(P＞0.05)，见图3B。

图1 ATV对NSCLCs细胞增殖的影响

图2 ATV对NSCLCs细胞RhoA活性的影响

2.4 RhoA siRNA对NSCLCs细胞增殖的影响

各组间β-actin表达无显著差异(P＞0.05)，表明各组间蛋白的上样量基本一致。与未转染组比较，A549细胞、H358细胞、Calu3细胞被转染control siRNA后，三株细胞内RhoA表达无显著变化(P＞0.05);但细胞被转染RhoA siRNA后，RhoA蛋白的表达明显下降，其抑制率分别为(76.23±8.05)%、(73.83±6.04)%、(77.97 ±10.98)%，表明转染 RhoA siRNA 能有效沉默三株NSCLCc细胞的RhoA蛋白表达，见图4A。与未转染组(control)比较，转染control siRNA组的细胞增殖无显著变化(P ＞0.05);转染 control siRNA 并合用 2.5 μmol/L ATV 组、转染 control siRNA 并合用10.0 μmol/L ATV 组、转染RhoA siRNA组、转染 RhoA siRNA 并合用2.5 μmol/L ATV 组、转染 RhoA siRNA并合用10.0 μmol/L ATV组均能显著抑制三株细胞增殖(P ＜0.01)。但是，与仅转染RhoAsiRNA组比较，转染RhoA siRNA并合用2.5 μmol/L ATV组、转染 RhoA siRNA并合用10.0 μmol/L ATV 组均无显著差异(P ＞0.05)，见图 4B。

图3 RhoA特异性抑制剂对NSCLCs细胞增殖的影响

图4 RhoA siRNA对NSCLCs细胞增殖的影响

3 讨论

近年来发现，他汀类药物还对肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导分化或凋亡、抑制血管生成及降低侵袭转移能力等作用［8］。ATV对乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌等肿瘤细胞增殖均有显著抑制作用［9］，是一种很有潜力的抗肿瘤药物。

RhoA属于GTP/GDP结合GTP酶的Ras超家族，已被证明在促进肿瘤细胞的增殖和凋亡中发挥重要作用［10］。RhoA在多种肿瘤细胞中过度表达和过度激活［11］。过度活化的RhoA能触发后续的PI3K-Akt通路的激活，而该通路被认为是调节细胞生成及细胞增殖的关键通路［12］。Fromigue 等［13］研究发现，高剂量的ATV(10 μmol/L)可有效抑制RhoA介导的基质金属蛋白酶的激活，从而抑制骨肉瘤细胞生长和侵袭。然而，ATV能否影响 NSCLCs细胞的 RhoA活性以及RhoA激活是否与NSCLCs细胞增殖有关仍不清楚。本研究中，ATV呈浓度依赖性地显著抑制NSCLCs细胞增殖，并且呈浓度依赖性和时间依赖性地显著抑制NSCLCs细胞的RhoA活性。用RhoA特异性抑制剂C3 transferase降低RhoA活性会明显抑制NSCLCs细胞增殖。我们进一步用RhoA siRNA转染NSCLCs细胞，证实在有效沉默RhoA蛋白表达后，也会明显抑制NSCLCs细胞增殖。该结果提示，ATV能有效地抑制NSCLCs细胞增殖，其机制与其降低 NSCLCs细胞的RhoA活性密切相关。

此外，本研究发现，用 RhoA特异性抑制剂C3 transferase或RhoA siRNA抑制RhoA活性时，联合应用ATV不能产生抑制NSCLCs细胞增殖的协同效应，而是与单用RhoA特异性抑制剂C3 transferase或RhoA siRNA的作用相似。这提示，在RhoA活性被抑制后，ATV不能抑制NSCLCs细胞增殖。如果ATV抑制NSCLCs细胞增殖不是通过抑制RhoA活性而产生，那么在RhoA活性被抑制后，ATV还应发挥本身对NSCLCs细胞增殖的抑制作用。相似结果在其他文献中也有报道，如Wang等研究发现［14］，重组的人肝细胞生长因子(rh-HGF)能促进骨肉瘤细胞生存从而抵消顺铂的治疗作用，用抗HGF中和抗体治疗能明显增强顺铂的细胞毒性，但用Akt siRNA阻断Akt表达时，rh-HGF和抗HGF的中和抗体对顺铂的细胞毒性仅为微弱作用或无作用。因此Wang等认为rh-HGF和抗HGF中和抗体对顺铂疗效的影响主要是依赖于对PI3K-Akt通路的抑制。本研究的上述结果也证实了此观点。因此，本文认为，RhoA激活与NSCLCs细胞增殖密切相关，ATV主要依赖于抑制RhoA活性从而减少NSCLCs细胞增殖。这提示，ATV可能作为一种有潜力的抗肿瘤药物用于NSCLCs的治疗，但其具体的作用机制和信号途径仍需进一步阐明。

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