经腹腔暴露2，5 -己二酮致大鼠脊髓组织细胞凋亡的研究

董 伟，邱泽文，刘 爽，朴丰源

(1.大连医科大学 劳动卫生与环境学教研室，辽宁 大连116044;2. 大连医科大学 实验动物中心，辽宁 大连116044)

正己烷在工业上广泛用于粘胶配制、制鞋、油漆、家具制造及电器制造业等。正己烷虽属低毒类有机溶剂，但因其高挥发性和高脂溶性，且具有蓄积和神经系统毒性作用，也是一种高危险毒物［1］。当人们长期低浓度接触正己烷，可导致以感觉运动型多发性周围神经病为主要临床特征的慢性中毒［2］。代谢动力学研究表明，2，5 -己二酮(2，5 -HD)是正己烷的活性代谢产物，它介导了正己烷引起的神经损伤［3］。然而，其毒作用机制并不十分清楚。细胞凋亡也称为程序性细胞死亡，是一种由基因控制的细胞主动死亡过程。在一定程度上，细胞凋亡对生物体维持自身稳定具有重要作用，而细胞凋亡调控失常常参与多种疾病的发生与发展。早在1996年，Ogawa 等［4］用低浓度的2，5 -HD 对小鼠的背根神经节细胞进行培养，出现了明显的凋亡现象。Boekelheide 等［5］发现2，5 -HD 可诱导精子细胞凋亡。这些文献提示，正己烷具有诱导组织细胞凋亡作用。但有关正己烷暴露诱导实验动物脊髓组织细胞凋亡的研究，尚报道较少。

本研究拟通过腹腔给大鼠暴露2，5 -HD 5 周，制作正己烷致周围神经损伤动物模型。用神经行为学评价方法、TUNEL -Hoechst 双染技术和Western Blot 检测技术，观察染毒大鼠脊髓组织细胞凋亡及凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax 的表达变化，探讨其毒作用机制。

1 材料和方法

1.1 试 剂

2，5-HD，购于美国sigma 公司，纯度≥99%。氯仿(福晨化学试剂厂，中国);异丙醇(科密欧化学试剂公司，中国);乙醇(新兴试剂厂，中国);RIPA 强裂解液(碧云天，中国);PMSF(碧云天，中国);BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，中国);兔抗大鼠Bcl-2抗体(赛信通，美国);兔抗大鼠Bax 抗体(赛信通，美国);小鼠抗大鼠β-actin 抗体(中杉金桥，中国);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(中杉金桥，中国);辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(中杉金桥，中国);超敏ECL 化学发光试剂盒(碧云天，中国);其他试剂均为分析纯级。

1.2 仪 器

T100TMThermal Cycler(伯乐，美国);PowerPacTM通用电泳仪电源和Mini -PROTEAN®Tetra 电泳槽(伯乐，美国);ChemiDocTMXRS + System(伯乐，美国);荧光显微镜(奥林巴斯，日本)。

1.3 动物分组与染毒

健康成年雄性SD 大鼠40 只，体重200 g 左右，购自大连医科大学实验动物中心。将40 只SD 大鼠按体重随机分为4 组，对照组，低剂量组，中剂量组和高剂量组每组10 只。将2，5 -HD 溶于0.9%生理盐水，经腹腔注射染毒。低剂量组，中剂量组和高剂量组染毒量分别为100 mg/kg，200 mg/kg，400 mg/kg，注射量为0.3 mL/100g，对照组以相同剂量的生理盐水进行腹腔注射。每天1 次，每周5 d，共染毒5 周。

1.4 一般情况与神经行为观察

每周观察大鼠的中毒症状，并对大鼠进行神经行为学评价。将大鼠置于一开旷的地面上，每只动物观察3 min。按照文献［6］，对大鼠步态进行评分，其评分标准为:(1)正常、未受影响的步态，步态评分为1 分;(2)轻度异常步态(如脚尖着地、后肢内收)，步态评分为2 分;(3)中度步态异常(明显的以膝关节下降和拖尾为特征的运动异常)步态评分为3 分;(4)严重步态异常(如后肢拖拉和完全无法站立)等，步态评分为4 分。

1.5 蛋白提取及Western Blot

将0.1 g 脊髓组织置于1.5 mL Eppendorf 管中，加入预冷的RIPA 强裂解液500 μL，使用组织匀浆器匀浆。静置10 min，然后以12 000 r/min 转速、4 ℃离心20 min，将上清转移至新Eppendorf 管，分装并加入适量的蛋白上样缓冲液于-80 ℃保存;使用BCA 比色法测定蛋白浓度。将等质量的总蛋白依次进行SDS -PAGE 分离1 h，转膜2 h。转膜结束后，取下PVDF 膜，放入5% 脱脂奶粉封闭液中，室温封闭1.5 h。然后将PVDF 膜置于5%脱脂奶粉稀释的兔抗大鼠Bax 抗体(一抗，1∶1 000)，兔抗大鼠Bcl-2 抗体(一抗，1∶1 000)及小鼠抗大鼠β- actin(一抗，1∶500)中，4℃过夜。TBST 洗膜3次，每次5 min。再将膜置于5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG (二抗，1∶5 000)及辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(二抗，1∶5 000)，37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min。使用超敏ECL，在美国Bio -rad 公司Chemi-DocTMXRS +凝胶成像系统对PVDF 膜进行扫描分析，计算公式为:某样品Bcl -2 或Bax 蛋白的相对表达水平=样品Bcl-2 或Bax 的IOD 值/样品βactin 的IOD 值。

1.6 TUNEL-Hoechst 染色

对照组和染毒组大鼠各4 只，将大鼠用戊巴比妥纳(200 mg/kg)麻醉，经4% 多聚甲醛溶液(pH7.4)灌流2 h。将大鼠置于冰上，取出脊髓，放入4%多聚甲醛溶液中固定。将固定好的组织进行石蜡包埋，切片机进行切片，每片5 μm 厚，贴片待用。TUNEL 染色采用In Situ Cell Death Detection Kit (罗氏，德国)试剂盒，主要步骤:将切好的切片进行脱蜡浸水，将切片浸入到新鲜配制的孵育液中(0.1% Triton X-100，0.1% sodium citrate)，25 ℃，8 min。将50 μL TUNEL 反应混合液滴加到样本上，37 ℃，60 min;之后用Hoechst 33342 (1 mg/mL)染色8 min。最后，用防猝灭封片剂封片，4 ℃，暗室，放置12 h，然后于荧光显微镜下进行检测，并拍照。在400 倍光镜下，随机选择5 个视野并计数500 个细胞，并记录阳性细胞数。计算细胞凋亡指数(AI)，AI=(凋亡细胞数/500)×100%。

1.7 统计学方法

所有实验数据采用均数± 标准差表示，用SPSS13.0 统计学软件进行One - Way ANVOA 分析，两两比较采用LSD 检验，P ＜0.05 被认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠的一般状况及步态评分

对照组大鼠站立姿势及行走步态正常，无异常改变(图1A)。2，5 -HD 染毒组大鼠逐渐出现被毛污秽、无光泽、明显消瘦、活动减少、肌张力下降等中毒症状，后期出现步态不稳、脚掌呈外“八”字形鸭步等症状，并随染毒时程进行性加重，直至完全瘫痪(图1B)。到第5 周染毒结束时，3 个染毒组的步态评分值分别为1.80 ±0.42、2.80 ±0.42 和3.94 ±0.24，明显高于对照组(P ＜0.01)。尤其400 mg/kg 2，5 - HD 染毒组，9 只大鼠出现重度异常(4分)，1 只大鼠出现中度异常(3 分)，其步态评分值为各组中最高的。具体见表1。

图1 2，5 -HD 染毒5 周后大鼠的状态Fig 1 The status of rats for 5 weeks after 2，5 -HD exposure by intraperitoneal injection

表1 2，5 -HD 对大鼠步态评分的影响Tab 1 The effect of 2，5 -HD on the gait score of the rats

2.2 TUNEL-Hoechst 染色观察大鼠脊髓组织细胞凋亡

TUNEL-Hoechst 凋亡染色观察结果显示，对照组在视野下，几乎见不到凋亡阳性细胞(图2A)。在100 mg/kg 和200 mg/kg 染毒组大鼠脊髓切片中，发现一些呈绿色荧光的凋亡阳性细胞(图2B，C)，而在400 mg/kg 染毒组大鼠脊髓切片中，可见较多的凋亡阳性细胞(图2D)。各染毒组大鼠脊髓细胞的凋亡指数分别为100 mg/kg 染毒组5.00 ±1.20;200 mg/kg 染毒组12.00 ±1.31;400 mg/kg 染毒组21.00 ±1.36，均明显高于对照组，P ＜0.01，且随着染毒剂量的增高而增多(图3)。

图2 各组大鼠脊髓组织细胞TUNEL-Hoechst 染色出现凋亡结果Fig 2 Observation of spinal cord cell in rats exposed to 2，5 -HD by TUNEL-Hoechst staining

图3 四组的凋亡指数分析Fig 3 Analysis of apoptotic index in the 4 groups

2.3 2，5 -HD 对脊髓组织Bcl-2 和Bax 蛋白表达影响

Western Blot 检测结果显示，2，5 -HD 染毒组大鼠脊髓组织中Bcl -2 蛋白表达明显低于对照组(P ＜0.01)，并随染毒剂量的增加而降低(图4)。而2，5 -HD 染毒组大鼠脊髓组织中Bax 蛋白表达明显高于对照组(P ＜0.01)，并随染毒剂量的增加而增加(图5)。染毒大鼠脊髓组织Bax/Bcl -2 蛋白表达比值明显高于对照组(P ＜0.01)(图6)。

图4 各组大鼠脊髓组织中Bcl-2 蛋白表达Fig 4 Expression of Bcl-2 protein in spinal cord of rats in the 4 groups

图5 各组大鼠脊髓组织中Bax 蛋白表达Fig 5 Expression of Bax protein in spinal cord of rats in the 4 groups

图6 各组大鼠脊髓组织中Bax/Bcl-2 比值Fig 6 The ratio of Bax/Bcl -2 in spinal cord of rats in the 4 groups

3 讨 论

正己烷作为有机溶剂，广泛应用于机械清洗、工业粘胶配制、制造、制球、印刷、家具制造及电器制造等传统领域和电子、微电子等新兴高科技产业领域。美国、加拿大、巴西、南非及中国的台湾、香港等地，相继有职业性正己烷中毒报道［7-8］。特别在中国，几乎每年都有群体性慢性正己烷中毒发生，已成为中国严重职业病之一。

正己烷慢性毒性主要表现为周围神经病，引起神经毒性作用主要是由其代谢产物——2，5 -己二酮(2，5 - hexanedione)所致。本实验结果表明，2，5 -HD 染毒组大鼠出现步态不稳、脚掌呈外“八”字形鸭步等症状，并随染毒时程进行性加重，直至完全瘫痪。到第5 周染毒结束时，各染毒组的步态评分值明显高于对照组。尤其在400 mg/kg 2，5 -HD染毒组，10 只大鼠中有9 只出现神经行为重度异常，其步态评分值为各组中最高。提示本实验设计剂量染毒2，5 -HD 可诱导大鼠周围神经损伤。凋亡是多种多神经毒物导致神经损伤的重要机制之一，如铅、铝等均可诱导神经细胞发生凋亡［9-10］。本实验TUNEL -Hoechst 双染结果显示，染毒组大鼠脊髓组织切片可见绿色荧光凋亡阳性细胞，其凋亡指数(AI)高于对照组，且随着染毒剂量的增高而增多。Western Blot 检测结果显示，2，5 -HD 染毒大鼠脊髓组织Bax 蛋白表达水平明显高于对照组，而染毒大鼠脊髓组织Bcl -2 蛋白表达量明显低于对照组。染毒大鼠脊髓组织Bax/Bcl -2 蛋白表达比值显著高于对照组。Boekelheide 等［5］发现，2，5 -HD 可诱导精子细胞凋亡。Ogawa 等［4］也报道，低浓度2，5 -HD 暴露可引起小鼠背根神经节细胞出现明显的凋亡现象。上述文献结果进一步支持本研究的发现。本研究结果表明，经腹腔暴露2，5 -HD 可诱导大鼠脊髓组织细胞凋亡，上调Bax 蛋白表达和下调Bcl -2 蛋白表达。2，5 -HD 诱导大鼠脊髓组织细胞凋亡可能与Bax/Bcl-2 通路紊乱有关。

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