大豆异黄酮载药纳米颗粒对肝纤维化大鼠的抗过氧化作用

罗海峰，杜 渐，孟 辉，巩 鹏，牟国煜，谭 广，王洪江

(大连医科大学 附属第一医院 肝胆外科，辽宁 大连116011)

大豆异黄酮(soybean isoflavones，SI)是一种植物雌激素，现代医学研究表明SI 具有抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗放射线损伤、抗氧化等多方面的作用。肝纤维化是肝脏在慢性肝损伤因子的作用下形成的肝细胞破坏，纤维组织增生的过程，是肝损伤发展为肝硬化的过渡阶段。目前认为肝纤维化的过程是可逆的。本实验旨在观察大豆异黄酮载药纳米颗粒对肝纤维化大鼠的抗过氧化作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 动物:健康清洁级SD 大鼠120 只，雄性，体重(250 ±30)g，由上海交通大学医学院实验动物中心提供，普通级饲养条件。

1.1.2 主要试剂:四氯化碳分析纯:上海凌峰化学试剂公司。橄榄油化学纯:上海凌峰化学试剂公司。大豆异黄酮:浙江欣欣生化试剂公司。氯化亚铁、氯化铁分析纯:上海凌峰化学试剂公司。

1.1.3 主要器材:全自动分光光度计(日本日立公司)、光学显微镜(Leica 公司)、高效液相色谱仪(上海精科)、恒温搅拌器(上海生物机械)。

1.2 方 法

1.2.1 动物分组:按照随机数字法将大鼠分组:对照组、肝纤维化组、空白纳米颗粒组(SPIO 组)、大豆异黄酮组(SI 组)、载药纳米颗粒组(SI -SPIO 组)，每组24 只。除对照组外，其他各组均采用四氯化碳∶橄榄油=1∶1 比例，灌胃0.8 mL/100 g，每周2次，共8 周。SI 组、SPIO 组和SI -SPIO 组分别给予大豆异黄酮DMSO 溶液(75 mg/kg)，空白超顺磁性氧化铁纳米颗粒(5. 0 mg/kg)，载药纳米颗粒低、中、高3 个剂量2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、7.5 mg/kg，经预实验筛选使用中剂量组用于本实验，自注射四氯化碳之日起，每3日尾静脉注射1 次。

1.2.2 载药纳米颗粒制作:参照文献［1-2］，采用共沉淀法:将2.5 g 葡聚糖T- 40、1.14 g 三氯化铁和0. 43 g 氯化铁(二者摩尔比接近2∶1)混合，充氮气条件下，搅拌并加入氨水4 mL 及超纯水11 mL 保持pH 值＞9. 2;之后在恒温磁力搅拌器中以800 r/min、65 ℃的条件反应7 h。加入适量冰乙酸，调节pH 值至中性;再将反应物10 000 G 离心15 min，取上清液，超纯水稀释100 倍，放置透析袋过滤24 h，0.22 Pm 滤膜再过滤，超声振荡5 min，高效液相色谱纯化并分装后，置于4 ℃冰箱备用。

量取油酸包裹Fe3O4纳米粒子0.2 mL，加2 倍量乙醇，超声分散，磁吸附(即把磁铁置于容器底部，静置3 min，SPIO 在磁力的作用下被吸附下来)，弃上清液，减压挥干乙醇，得黑色固体，再加四氢呋喃(THF)5 mL，超声分散，加入表面活性剂B188 1.2500 g 和SI 0.0065 g，再加THF 10 mL，超声分散，在涡旋的条件下用注射器将上述溶液缓慢注入150 mL 水中，探头超声3 min，功率750 W，超声2 s，暂停2 s。透析24 h 除去有机溶剂，0.22 μm 微孔滤膜过滤，制得SI-SPIO 纳米粒的水溶液［3］。

取适量样品，应用X 射线粉末衍射法、透射电镜、原子力显微镜及振动样品磁强计检测其相关理化指标，包括核心粒径、颗粒大小、比饱和磁化强度、比剩余磁化强度和剩磁等。

1.2.3 肝功能测定和肝脏过氧化指标测定:8 周后处死各组大鼠，处死前心脏穿刺抽血8 mL，离心取血浆，检测AST、ALT、TP、Alb。取肝组织匀浆，测定MDA、GSH-Px 和SOD 过氧化指标。测定方法按照各试剂盒说明书进行。

1.2.4 肝脏组织学观察:按照8 周后处死大鼠，肝脏10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片HE 染色，于显微镜下观察。根据1995年北京制定的肝纤维化程度分级标准(S0 无明显变化;S1 汇管区扩大，纤维化;S2 纤维间隔形成，小叶结构保留;S3 纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化;S4 早期肝硬化)评估各组纤维化程度分级，进行对比。

1.3 统计学方法

数值均使用平均值±标准差的形式表示，统计采用SPSS18.0 软件，计量资料采用单因素方差分析，等级分组资料秩和检验(Kruskal-Wallis 检验)，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 自制SPIO 和SI-SPIO 的理化性质

SPIO 核心颗粒约6 ～8 nm，载药纳米颗粒直径约25 nm，饱和磁化强度为67.36488 emu/g Fe，比饱和磁化强度69. 82151 emu/g，比剩余磁化强度为32.5472 emu/g，剩磁为22.61721 Gs (几乎为0)。SI-SPIO 水溶液中SI 质量浓度(29.5 ±0.9)μg/mL，包封率(71.3 ±1.6)%。

2.2 各组肝功能指标变化情况

与对照组相比，肝纤维化组和SPIO 组ALT、AST 明显升高，ALB 明显降低(P ＜0.05);SI 组和SI-SPIO 组与肝纤维化组相比，ALT 和AST 明显降低，ALB 明显升高(P ＜0.05)。SI -SPIO 组肝脏功能较SI 组改善更为明显(P ＜0.05)。见表1。

2.3 肝组织匀浆中抗过氧化指标检测情况

与对照组相比，肝纤维化组和SPIO 组MDA 明显升高，GSH -Px 和SOD 明显降低(P ＜0.05);SI组和SI -SPIO 组与肝纤维化组相比，MDA 明显降低，GSH - Px 和SOD 明显升高(P ＜0. 05)。SI -SPIO 组过氧化指标较SI 组改善更为明显(P ＜0.05)。见表2。

表1 各组肝功能指标变化情况Tab 1 Liver biochemical indicators of each group

表2 肝组织匀浆中抗过氧化指标检测情况Tab 2 Peroxidative indicators in livers of each group

2.4 肝脏组织学观察和各组肝纤维化程度评估

肝纤维化组和SPIO 组较对照组呈现明显的肝纤维化，肝脏纤维间隔形成，小叶结构不同程度保留或紊乱，汇管区增宽，炎性细胞浸润等。SI 组和SISPIO 组肝纤维化程度较肝纤维化组和SPIO 组明显减轻，但未达到对照组水平。按纤维化程度分级标准，经过秩和检验，各组间差异具有显著性意义(P ＜0.05)，见表3、图1。

表3 肝纤维化程度分级例数列表Tab 3 Histological fibrosis grades of each group (n)

图1 各组肝脏组织学光镜图片(×200)Fig 1 Light microscope images of liver histology(×200)

3 讨 论

肝细胞损伤因子如酒精、肝炎病毒等长期作用于肝脏细胞，造成肝脏细胞的过氧化损伤是肝纤维化形成的主要因素，受损的肝细胞和一些间质细胞如肝星状细胞释放大量的氧自由基，进而激发炎症因子和转化生长因子(transforming growth factor，TGF)，血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)等细胞因子的释放，形成炎症放大级联反应，造成大量的细胞外基质沉积和纤维增生。1999年，Yasuda 首次提出雌激素对肝纤维化形成的保护作用。一定浓度的雌二醇(estradiol，E2)能够抑制大鼠肝纤维化，主要表现在I、III 型胶原和基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)的mRNA 表达降低，在体外实验中也观察到一定浓度的E2(＞10-7mmol/L)能够抑制肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)分泌I 型胶原，α-平滑肌肌动蛋白(α -smooth muscle actin，α-SMA)表达降低。雌激素主要与细胞胞浆内受体结合，其复合物进入细胞核影响细胞DNA 合成;同时雌激素的代谢产物:2 -羟基雌二醇(2OHE)、2 -羟甲基雌二醇(2MeOE)也具有抗过氧化、抗炎症因子等多种生物学活性［4］。大豆异黄酮(SI)是一种植物雌激素。已有实验证实，SI 具有抗氧化、抗炎和抑制免疫激活等作用［5］。动物实验表明，SI对于小鼠急性肝损伤具有保护作用，它可增加肝细胞膜的稳定性，减少钙离子内流，抑制肝星状细胞的激活和增殖，减少TGF 等细胞因子分泌，减少细胞外基质沉积，减轻肝纤维化［6］。

近年来，随着纳米技术在医药领域的广泛应用，载药纳米粒子引起人们的关注［7-8］。纳米载药系统的优势在于:(1)靶向输送、具有靶场响应性。如SPIO 靶向定位于肝脏、脾脏等网状内皮系统丰富的脏器，外加磁场可增加靶向性分布，有利于集中给药;(2)缓慢释药，作用更持久;(3)粒子直径小，可以通过毛细血管内皮间隙，使药物到达细胞内，有利于药物与细胞内受体结合［9-10］。本研究采用SPIO纳米颗粒作为给药系统，可将SI 靶向输送至肝脏，使药物作用集中于肝脏，发挥较好的疗效。研究发现，SI 和SI-SPIO 能够较好的改善四氯化碳造成肝脏损伤，降低肝脏的ALT、AST，升高ALB。同时SI和SI-SPIO 也有较强的抗氧化功效，能够明显减少纤维化肝脏的脂质过氧化反应，从而对肝脏起到保护作用。本研究结果显示，由于采用纳米给药系统，增加了药物对肝脏的靶向性，相对于SI 全身静脉给药，SI -SPIO 组各抗氧化指标较SI 组有明显差异，纳米给药系统能够更好发挥药物的抗氧化能力。这些都为今后进一步探讨采用纳米技术，靶向给药，有效地利用大豆异黄酮治疗肝纤维化提供了依据。

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