左氧氟沙星热敏性凝胶制备及局部治疗大鼠化脓性中耳炎的研究△

李聪 程雪峰 顾健 敖华飞 王勤

·基础研究·

左氧氟沙星热敏性凝胶制备及局部治疗大鼠化脓性中耳炎的研究△

李聪 程雪峰 顾健 敖华飞 王勤

目的评价左氧氟沙星热敏性凝胶对大鼠化脓性中耳炎的治疗效果。方法采用冷凝法制备以泊洛沙姆407为基质的左氧氟沙星热敏性凝胶；采用经鼓膜注入金黄色葡萄球菌的方法建立大鼠化脓性中耳炎模型；将诱导化脓性中耳炎成功的模型动物随机分为4组：生理盐水组（A组）、左氧氟沙星溶液组（B组）、泊洛沙姆407组（C组）、左氧氟沙星热敏性凝胶组（D组），各组分别在用药后的3、7、10、14 d于显微镜下观察鼓膜情况。结果治疗初期B组和D组无明显差别，用药后14 d显微镜下D组局部炎症明显轻于B组，并在观察期间没有出现反复。结论左氧氟沙星热敏性凝胶对化脓性中耳炎的治疗有效，可作为治疗化脓性中耳炎的新剂型做进一步的研究。（中国眼耳鼻喉科杂志，2013，13：372-375）

左氧氟沙星；热敏性凝胶；化脓性中耳炎；局部治疗

化脓性中耳炎是耳鼻咽喉科常见疾病，其病理改变主要是中耳鼓室黏膜化脓性炎症，主要的治疗方式是抗菌药物的使用。左氧氟沙星是一种广谱、高效的喹诺酮类抗菌药；泊洛沙姆407（poloxamer407，P407）是研究、应用最为广泛的一种热敏性凝胶，具有低温时为液体，温度升高时转变为凝胶的反向热敏凝胶特性。这样便可以液体形式给药，药液在中耳内立刻转变成凝胶，能够达到延长药物在中耳内的滞留时间，提高药物生物利用度的效果。我们前期研究了以P407为基质制备的左氧氟沙星凝胶，并对其体外释放性能进行了检测，得出该热敏性凝胶具有较好的控释性能［1］。故本研究将该热敏性凝胶应用于体内，观察其治疗效果，以期使之成为治疗中耳炎的理想制剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠32只，体质量220～250 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司［SCXK（沪）2008-0016］，合格证编号：2008001618815，无噪声暴露和药物使用史，耳廓反射灵敏，电子耳镜检查外耳道、鼓膜均无异常，术前均进行听性脑干反应（ABR）、声导抗结果均在正常范围内。

1.1.2 试剂及仪器设备 左氧氟沙星（上海楷洋生物有限公司）；P407（商品名为普朗尼克F127，平均相对分子质量：11 500，上海楷洋生物有限公司）；左氧氟沙星对照品（中国药品生物制品检定所）；其他试剂均为分析纯。1×108/L金黄色葡萄球菌液（上海交通大学医学院附属第三人民医院检验科）。仪器设备MD100-1电子天平（上海天平仪器厂），88-I型定时恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司），电子耳镜（湛江市聆听听力仪器中心）。

1.2 方法

1.2.1 左氧氟沙星热敏性凝胶的制备 参照本实验组已报道的冷溶法制备左氧氟沙星热敏性凝胶，用注射用水配成浓度为17％的P407溶液，然后加入左氧氟沙星，使溶液中的左氧氟沙星浓度为3 mg/mL；磁力搅拌器搅拌均匀，置于4℃左右冰箱冷藏溶胀24 h，使凝胶充分溶胀，分散均匀，得澄清溶液。

1.2.2 化脓性中耳炎模型的建立及评估 SD大鼠用戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉后，用安尔碘消毒术耳及外耳道皮肤，采用1mL无菌注射器抽取1×108/L金黄色葡萄球菌液0.1 mL，在手术显微镜直视下于鼓膜前下方缓慢注入SD大鼠左侧中耳腔内，作为实验耳，对侧右耳作为对照耳，经鼓膜注入等量（0.1 mL）的生理盐水。隔3 d在无菌条件下沿前次注射孔再次注射，共连续注射3次。在清洁安静的饲养条件下喂养，观察期间未给SD大鼠进行任何治疗。造模后第1、2、3周分别在显微镜下观察鼓膜形态的变化。

1.2.3 分组与干预 在造模后第3周，将32只已经造模成功的SD大鼠按照随机原则分为4组。A组：生理盐水组；B组：左氧氟沙星溶液组（3 mg/mL）；C组：含17％P407组；D组：左氧氟沙星热敏性凝胶组。用药方式为显微镜下经鼓膜一次性直接注射0.1 mL至鼓室内。各组SD大鼠分别在用药当天及用药后3、7、10、14 d分别在显微镜下观察鼓膜形态的变化。

1.2.4 光镜下观察局部病理变化 用药后的第7天在D组随机选取1只SD大鼠，用戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉后，经鼓膜注入10％甲醛溶液0.05 mL，快速断头处死，将颞骨完整取下，于10％甲醛溶液固定12 h，10％中性乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脱钙常规石蜡包埋。所有的颞骨切片均为与蜗轴平行的水平做以4μm层厚切片，取与蜗轴对应的中耳腔黏膜区域作为观察区域，行常规苏木素-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色。

2 结果

2.1 左氧氟沙星热敏性凝胶的基本性质 本实验制备的凝胶在常温下成液体状态，在接近人体中耳内温度34℃时形成凝胶。

2.2 动物模型构建结果 对照耳各时间段鼓膜均未见明显异常。实验耳在注入金黄色葡萄球菌液后1周时均出现急性中耳炎，鼓膜广泛充血、膨隆，透过鼓膜可见鼓室内有渗液。2周左右时有23只实验耳鼓膜膨隆向外，呈半球形泡，表面充血明显；8只实验耳的鼓膜充血减轻，鼓室内有少量渗液渗出。3周后（图1A）有21只实验耳鼓膜穿孔，鼓室内可见大量黄色黏稠脓性分泌物；10只实验耳鼓膜明显增厚，呈黄色化脓样改变。

2.3 药物治疗效果 由于构建模型时1只SD大鼠因麻醉过量致窒息死亡，所以最后纳入药物干预实验的SD大鼠实际数量为31只。将31只大鼠随机进行分组，A组7只、B组8只、C组8只、D组8只。

药物注射后A、B、C、D各组对照耳各时间段鼓膜均未见明显异常。药物注射后A组、C组的大鼠实验耳炎症程度未得到控制，进一步恶化，黄色黏稠脓性分泌物增加，部分鼓膜未穿孔的实验耳出现了鼓膜穿孔。药物注射后第3天B组、D组的大鼠实验耳炎症程度都得到了一定的控制，黄色黏稠脓性分泌物减少，两者差异不明显。药物注射后第7天B组大鼠实验耳炎症程度出现了反复，再次恶化，黄色黏稠脓性分泌物增加，鼓膜充血加重；药物注射后第14天时大鼠实验耳的炎症程度均较重，与A组、C组大鼠实验耳无明显差异。而从药物注射后第7天开始，D组大鼠实验耳的炎症程度进一步得到了控制，黄色黏稠脓性分泌物进一步减少，鼓膜充血减轻；至药物注射后第14天大鼠实验耳与其对照耳对比，炎症程度基本消退。治疗期间未出现炎症反复（表1、图1）。

2.4 鼓室黏膜病理学变化 在药物注射后第7天随机选取1只大鼠，其耳镜下黏膜炎症程度为+。组织标本切片显示：大鼠对照耳（图2A）鼓室内侧壁黏膜呈单层扁平上皮，上皮下间隙菲薄，近咽鼓管口处及咽鼓管内为纤毛柱状上皮，纤毛上皮细胞之间有少量的杯状细胞，纤毛排列整齐规则，上皮下间隙明显厚于鼓岬，其中可见成纤维细胞，有时可见少量的单核细胞。实验耳（图2B）鼓室内侧壁上皮稍肿胀，上皮下间隙内有大量残留渗出的炎症细胞，以多形核中性粒细胞为主；可见大量的凝胶状空泡，空泡将炎症细胞包裹、消化，使炎症局限化。即该实验耳黏膜病理的炎症程度与耳镜下观察的一致。

表1 各组实验耳的炎症程度

图1. 用药后第7天各组耳镜下所见 A：生理盐水组，鼓膜化脓清晰可见，还有部分穿孔；B：左氧氟沙星溶液组，鼓膜充血，可见黄色化脓灶；C：P407组，鼓膜已穿孔，周围充血仍存在；D：左氧氟沙星热敏性凝胶组，残留鼓膜穿孔，但鼓膜干净，未见化脓灶

图2. D组病理切片 A：对照耳；B：实验耳

3 讨论

化脓性中耳炎［2］目前的主要治疗方式［3］为全身和局部应用抗菌药物：全身应用抗菌药物，缺点是药物达到患处需要一定的时间，而且局部药物浓度较低，故需要的治疗周期较长，对机体其他组织系统的影响较大；传统局部应用抗菌药物，如滴耳液，虽然克服了全身用药对其他组织系统的影响，提高了患处局部药物浓度，但是由于中耳的解剖结构特点，药物很容易从穿刺孔和咽鼓管中流出，造成药物在局部的作用浓度不恒定、作用时间短。虽然增加用药次数可一定程度上维持局部药物浓度，但也给患者使用带来不便。

化脓性中耳炎是由于细菌如链球菌、葡萄球菌和肺炎链球菌等通过鼻咽管侵入中耳腔后感染，引起的中耳鼓室黏膜化脓性炎症。其病理改变主要局限在中耳鼓室内，故我们认为主要的治疗方式是局部抗菌药物的使用。但传统用药很难使抗菌药物在局部保持较长的作用时间，因此如何保持抗菌药物在局部的长时间、有效浓度范围的作用一直是研究化脓性中耳炎治疗的关键。我们认为理想中的制剂应当满足2个条件：①较好的缓释性，能长期释药；②局部药物浓度恒定，作用时间长，在鼓室内能够长时间滞留。故我们结合当前药剂学研究进展，将热敏性凝胶应用于耳用局部药物的制备。

大鼠听泡的解剖及黏膜结构于人中耳鼓室结构非常相似，是研究中耳很好的动物模型。动物模型［4］的建立，为深入研究化脓性中耳炎的病理变化及治疗方法提供了客观依据。由于动物的愈合能力和抗感染能力亦较人类强，单次注射引发的中耳炎常可自愈，且痊愈期很短，影响了动物模型的建立。同时在阅读大量文献［5-8］的基础上，以及结合临床中化脓性中耳炎分泌物的细菌培养结果，显示革兰阴性杆菌的致病率最高。另外常见的菌种有：金黄色葡萄球菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）等。虽然致病菌具有一定的地区差异性，但金黄色葡萄球菌是化脓性中耳炎的常见致病菌。因此本实验就通过反复注射金黄色葡萄球菌，造成局部感染迁延不愈，评估该方法建立的化脓性中耳炎模型，显示出模型稳定、成功率高、操作简单等优点。这为进一步研究化脓性中耳炎的治疗方法奠定了基础。

热敏性凝胶是一种环境敏感性凝胶，选用其中的P407作为左氧氟沙星热敏性耳用凝胶的基质，因其具有较好的表面活性及良好的安全性［9］。另外，相关研究［10-12］表明它还具有较好的控释性、足够的药物携带量、良好的耐受性、易生物降解等优点。前期我们的体外实验研究也得出其具有较好的控释性，在本次体内实验中，与B组相比更加验证了这一点，与体外实验相吻合。另外，本次实验中，在D组右侧对照耳的基础上，我们增加了P407对照组，即C组，结果不仅说明了制备的左氧氟沙星热敏性凝胶具有一定的安全性，也进一步说明了P407具有一定的安全性，对局部的炎症无影响。

本实验中，我们成功制备了载药量大和具有较好缓释性的左氧氟沙星热敏性凝胶，并将其用于SD大鼠化脓性中耳炎的治疗。用药后第3天时，B组和D组对局部化脓性炎症的疗效并无差别，但随着局部药物浓度的改变，从用药后第7天开始，B组的炎症程度没有再下降，到第10天时，甚至有进一步加重的趋势，与D组相比具有显著的差异性。而D组实验耳的炎症程度没有反复，一直是趋于好转的状态。所以，可以认为左氧氟沙星热敏性凝胶的局部抗炎效果优于传统的左氧氟沙星溶液。由于实验条件有限，实验仅针对近期疗效进行观察评定，对于更长时间内，左氧氟沙星热敏性凝胶用于控制SD大鼠局部炎症是否会发生反复尚未知，还需在进一步研究中阐述。

［1］李聪，杨希之，敖华飞，等.左氧氟沙星热敏型耳用凝胶的制备及其性能检测［J］.中国眼耳鼻喉科杂志，2012，12（5）：285-288.

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Preparation of levofloxacin thermosensitive gel and local treatment of suppurative otitismedia in rats

LICong，CHENGXue-feng，GU Jian，AO Hua-fei，WANGQin.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，the Third People′s Hospital of Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 201900，China

WANG Qin，Email：cherry-cream＠hotmail.com

Objective To evaluate the therapeutic effects of levofloxacin thermosensitive gel on suppurative otitis media in rats.Methods Levofloxacin thermosensitive gel of poloxamer 407 as the matrix was prepared by the condensationmethod.Suppurative otitismedia model was established by injecting staphylococcus aureus into tympanic membrane.Thenmodels were randomly divided into four groups：the normal saline group（A），levofloxacin solution group（B），poloxamer 407 group（C）and levofloxacin thermosensitive gel group（D）.The tympanic membranes were observed under microscope after treatment for 3，7，10 and 14 days respectively.Results There was no significant difference in early treatment between group B and group D，but the degree of local inflammation of group D was significantly lighter than that of group B and had no repetition during the observation period.Conclusions Levofloxacin thermosensitive gel was effective for suppurative otitismedia suggesting that it can be used as a new form for treating suppurative otitismedia.（Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：372-375）

Levofloxacin；Thermosensitive gel；Suppurative otitismedia；Local treatment

2013-03-08）

（本文编辑 杨美琴）

上海交通大学医学院附属第三人民医院院基金项目（syz2010-07）

上海交通大学医学院附属第三人民医院耳鼻咽喉-头颈外科 上海 201900

王勤（Email：cherry-cream＠hotmail.com）

试题6.答案：与PVR形成有密切关系的是过度冷凝、电凝、多发视网膜裂孔、巨大视网膜裂孔、眼内炎症、多次眼内手术、眼外伤、长期孔源性视网膜脱离等。

试题7.答案：D。Behcet病好发于日本、中国、土耳其、伊朗、科威特等中东和地中海沿岸国家。