ELISA两步夹心法测定HBsAg在献血筛查中的应用

何星，洪茂，黄小明

(1、金华市中心血站，浙江金华321000;2、上海市第一人民医院宝山分院检验科，上海宝山200940;3、金华市第五医院，浙江金华321000)

ELISA两步夹心法测定HBsAg在献血筛查中的应用

何星1，洪茂2，黄小明3

(1、金华市中心血站，浙江金华321000;2、上海市第一人民医院宝山分院检验科，上海宝山200940;3、金华市第五医院，浙江金华321000)

目的评价无偿献血标本用ELISA两步法检测HBsAg模式应用的效果。方法对胶体金法筛查阴性无偿献血者标本45477份，采用ELISA一步法和两步法进一步复核对比分析。结果胶体金法均为阴性标本中，ELISA一步法282例HBsAg呈阳性，阳性率为0.62%；ELISA两步法586例HBsAg呈阳性，阳性率为1.29%,两种方法检测结果的差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论应用ELISA两步夹心法对献血者HBsAg实施检测对降低HBsAg漏检率具有重要的意义。

无偿献血;HBsAg;ELISA;两步法

我国是乙型肝炎高度流行区，乙肝表面抗原(HBsAg)携带者达7.18%[1]。为了保证安全输血，献血前应用胶体金法HBsAg的筛查，并用两种不同试剂进行两次ELISA方法的HBsAg检测，是目前采供血机构对献血者进行乙型肝炎表面抗原(HB-sAg)检测的主要策略。由于“一步法”存在产生“后带现象”的可能，为尽可能避免漏检，《中国药典》2010年版中取消一步法，仅收录二步法。我们用ELISA两步夹心法方法和一步法分别对我血站45477名献血员进行HBsAg感染检测，并分析这两种方法在测定HBsAg结果上的差异，现报告结果如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源2010年6月至2011年5月本站无偿献血者血液标本45477份。献血者献血前，均常规使用HBsAg金标试纸条进行初筛，结果阴性者方可献血。

1.2 试剂胶体金法HBsAg试剂为厦门英科新创公司产品。初检试剂(“一步法”)HBsAg为厦门英科新创公司产品,复检试剂(“两步法”)HBsAg为雅培公司，以上三种试剂均经过中国药品生物制品检定所批批检定，且在有效期内使用，操作严格按照说明书要求进行。

1.3 主要仪器Tecan Rsp150全自动加样仪(瑞士TECAN公司)；BepⅢ全自动酶免分析系统(德国Bering公司)；Xantus全自动加样仪(瑞士Sias公司)；FAME全自动酶免分析系统(瑞士HAMILTON

公司)；SUNRISE酶标仪(瑞士TECAN公司)； Columbus洗板机(瑞士TECAN公司)。

1.4 方法与结果判断

1.4.1 酶免疫“一步法”检测HBsAg原理，酶免疫“两步法”检测HBsAg原理[2]。

1.5 统计学方法SPSS17.0统计软件，率的比较用χ2检验，两均数比较用t检验，P＜0.05，为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二种方法检测45477份献血者的HBsAg结果情况一步法检测HBsAg阳性为282份，阳性率为0.62%(282／45477)，二步法检测HBsAg阳性为586份，阳性率为1.29%(586／45477)；在730份HBsAg阳性标本中，一步法的检出率为38.63% (282／730)，二步法的检出率为80.27%(586／730)。经统计学处理，两种方法检测结果差异有统计学意义(χ2=107.50，P＜0.01),见表1。

表1 45477份献血者的血清标本ELlSA法检测HBsAg结果[n(%)]

2.2 138份二种方法同时阳性标本的S/CO值情况当S/CO值在0.9～7.99时，经统计学处理，一步法和二步法检测HBsAg检测能力差异有统计学意义(t′=5.9693，P＜0.05)；当S/CO值≥8.0时，一步法和二步法检测HBsAg检测能力差异也有统计学意义。(t′=4.9581，P＜0.05)，见表2。

2.3 448份两步法阳性一步法阴性标本处理结果情况对448份标本同时做HBeAg,HBeAb和HBcAb三项检测，只要有一项有反应性记录为阳性，共记420份；其他三项检测均无反应性的28份。对420份有反应性的标本用一步法稀释处理，检测结果见表3。

表2 两种方法均为阳性的138例标本S/CO值比较

表3 一步法检测420份不同稀释标本的HBsAg结果

3 讨论

经过本次回顾性研究发现：所有献血者都在献血前用金标试纸条做了HBsAg初筛，因此大部分HBsAg携带者都被排除。但是受初筛试剂方法本身的限制，仍然有部分HBsAg阳性的标本被采集。本文收集从2010年6月到2011年5月对HBsAg进行检测的数据，包括使用国产新创试剂一步法数据和同时用进口雅培试剂两步法复检数据。由表1可见HBsAg阳性率，一步法为0.62%，两步法为1.29%，表明两步法检测水平明显高于一步法。通过表2，对比二种方法同时阳性标本的S/ CO值，同一标本两步法与一步法存在显著差异，而且两步法S/CO值普遍都要高，这也显示两步法比一步法检测能力要强。通过表3分析得出，随着稀释倍数增加，一步法阳性检出率逐步上升，漏检率明显下降。

笔者认为，一步法在检测HBsAg时，很可能出现过量的抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，却没有形成“HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP”复合物，即产生“钩状效应”[3]，尤其是高浓度的HBsAg导致“后带现象”，出现假低值，严重时可以造成假阴性。将这些标本进行适当倍数稀释后可以有效消除钩状效应，这与有关文献报道一致[4]。两步法通过把游离抗原(未与固相抗体结合的多余抗原)洗掉，再加酶标抗体，因为结合抗原是多价的，所以形成“HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP”复合物，最后催化底物，呈现阳性结果，有利避开“后带现象”(见表3)，而且不用稀释样本。至于28份HBeAg, HBeAb和HBcAb三项检测均为阴性标本，由于不同试剂厂家针对乙型肝炎病毒DNA的S基因编码的衣壳蛋白包被物差异或者其他不明原因造成。但是两种试剂都存在一定漏检率，因此同时使用两种不同试剂来检测对降低HBsAg漏检率有重要意义，这也符合国标“采出的血液必须进行初检和复检的要求”规定。

综上所述，此前ELISA一步夹心法灵敏度高，特异性好，耗时也不长久，因此得以广泛应用。但是近几年来相继有报道ELISA一步夹心法检测HBsAg也易出现假阴性结果[5]。作为经典的两步法，与ELISA一步夹心法检测HBsAg时对实验条件要求基本相同，不需要特别仪器和专门技术培训。笔者认为ELISA两步夹心法敏感性更高，有利于避免产生高值钩状效应和缩短HBV感染的“窗口期”[6]。血站应筛查出部分处于窗口期或对受血者相对不安全的血液，进一步降低输血风险。因此，在降低HBV传播风险提高血液安全性方面，两步法具有非常重要的意义，一步法与两步法联合使用，更能保证血液安全。

[1]卫生部疾病预防控制局,中国疾病预防控制中心.全国人群乙型病毒性肝炎血清流行病学调查报告[M].北京:人民卫生出版社, 2011:4.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:355.

[3]杨剑.ELISA一步法和两步法检测乙肝HBsAg的结果比较[J]实验与检验医学,2011,29(5):569.

[4]胡越,蒋瑞馨,邵家幼.两种酶联免疫吸附法检测乙肝表面抗原的结果比较[J].实验与检验医学，2012，30(3):269-270.

[5]风倩,陶传敏,严可明,等.ELISA一步夹心法检测HBsAg假阴性原因分析.[J]华西医学,2008,23(6):1394-1395.

[6]谢琳,易鸣,高命,等.ELISA一步夹心法检测HBsAg假阴性的原因及对策分析[J].现代临床医学,2011,37(3):211-212.

R446.62,R512.6+2,R193.3

A

1674-1129(2013)05-0498-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.039

洪茂