铜绿假单胞菌生物膜形成与眼部感染

陈薇婴综述，关禹博审校

(天津市眼科医院天津市眼科学与视觉科学重点实验室天津医科大学眼科临床学院检验科，天津300020)

铜绿假单胞菌生物膜形成与眼部感染

陈薇婴综述，关禹博审校

(天津市眼科医院天津市眼科学与视觉科学重点实验室天津医科大学眼科临床学院检验科，天津300020)

铜绿假单胞菌；生物膜；眼病

铜绿假单胞菌(PA)广泛分布于自然界、医院环境、医疗器械以及人类正常皮肤、肠道、呼吸道等，是极为常见的条件致病菌，是院内感染的主要致病菌之一。铜绿假单胞菌引起的一些迁延不愈的慢性感染性疾病与其在感染部位形成生物膜(biofilm,BF)有关。同样，一些眼部感染性疾病或一些生物材料植入而导致的并发症，也常常是因为感染了产生物膜的菌株，尤以产生物膜的铜绿假单胞菌为主，由于生物膜的产生使得该菌耐药性增强，从而导致治疗困难。

1 铜绿假单胞菌生物膜的形成

1.1 铜绿假单胞菌生物膜的形成过程细菌在自然界一般以浮游或聚集状态存在，但99%是以聚集状态即形成生物膜的方式侵入人体[1]，易在生物医学材料或机体黏膜上聚集，以抵御吞噬细胞的吞噬和机体的免疫系统。

铜绿假单胞菌侵入人体后，首先借助于鞭毛到达可黏附物表面并在其形成单层菌落，最初为可逆性黏附，后发展为不可逆黏附，随后在菌毛的作用下在黏附表面形成微菌落并最终形成成熟的生物膜[2]。

1.2 铜绿假单胞菌生物膜的分子结构铜绿假单胞菌侵入人体后即突变为黏液株，其自身分泌大量的胞外多糖并包裹细菌形成生物膜的主要成分，藻酸盐是胞外多糖的主要成分[3，4]，生物膜还含有细菌分泌的各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质。

1.3 铜绿假单胞菌生物膜形成的观察

1.3.1 染色法银染法一般是采用硅胶、聚氯乙烯或玻片等作为生物膜载体[5]，用5%AgNO3溶液染色后在普通光学显微镜下观察生物膜的形成。通过银染法发现[6]对照组镜检仅见散在的黑点或黑斑，细菌培养7d后黑染部分形成棉絮样的膜状物，说明有生物膜形成。

使用刚果红-阿利新蓝(AB)染液联合胞外多糖染色，细菌细胞呈淡红色，胞外多糖呈深紫红色，用扫描电镜观察发现形成生物膜的细菌紧密堆积且边缘不清晰，胞外多糖聚集成团围绕在菌体周围[7]。

染色法的优点是试验条件要求不高，试剂价格低廉，敏感性较好，但操作较繁琐且实验周期较长，有时可能影响生物膜的完整结构。

1.3.2 激光共聚焦显微镜铜绿假单胞菌的生物膜分别用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的刀豆蛋白A (FITC-ConA)和碘化吡啶(PI)进行免疫荧光染色，由于FITC-ConA与生物膜的胞外多糖结合可发出绿色荧光，PI可以和细菌的DNA结合发出红色荧光，因此可在激光共聚焦显微镜下对生物膜的形成进行动态观察。使用盖玻片生物膜培养法观察发现[8]，在最初的16h，细菌无多糖产生，24h后细菌不断聚集并开始大量产生多糖，生物膜初步形成，72h后生物膜基本分化成熟。该方法对细菌及其生物膜无损伤，可直接观察生物膜形成的动态过程，并且可以对生物膜的各种指标如生物膜的厚度、均一性、比表面积、各种荧光的强度等多个参数进行量化，是目前较为理想的生物膜检测方法[9]。

2 铜绿假单胞菌生物膜形成的调节机制

群体感应(quorum sensing,QS)是指当细菌的数量达到一定密度(quorum)时才发生感应现象(sensing)。目前研究发现，与PA生物膜相关的QS系统是las系统和Rh1系统[10,11]。Las系统由lasR和lasI基因组成，Rh1系统则包含rh1R和rh1I基因，las系统表达的信号分子为N-乙酰-高丝氨酸内酯, Rh1系统表达的信号分子是N-丁酰-高丝氨酸内酯，细菌在生长过程中可通过信号分子控制BF的发展成熟,并协调整个细菌群体行为,共同对周围环境刺激做出反应,增强整个细菌群体的生存能力。

一般情况下,铜绿假单胞菌侵入人体后72h即可形成较厚、分化良好、有孔状通道的生物膜结构。但研究发现[12]lasR基因缺陷型所形成的生物膜结构松散且发育迟缓，而rhlR基因缺陷型细菌则不能形成明显的生物膜。应用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)分子，利用脂质体转染成熟的生物膜，干扰铜绿假单胞菌群体感应系统的lasR、rhlR和rhll三个关键性基因，可以促进生物膜解体[13]。

镁离子等金属二价阳离子与细菌多糖及玻片载体所携带的负电荷互相吸引，有利于细菌相互聚集及与载体的吸附，因而有利于生物膜的形成。镁离子可以增加BF多糖的产生或者减少多糖的降解，使生物膜的结构更复杂，更能抵御抗生素的作用[14]。

铜绿假单胞菌的鞭毛的推动力在生物膜形成的早期细菌黏附阶段起重要作用，合成鞭毛的基因有40余种，其中最重要的是motA基因，它在生物膜的发展形成过程中发挥关键的调节作用[15]。

3 铜绿假单胞菌生物膜与眼科疾病

铜绿假单胞菌并非眼表的共生菌，不能定居于眼表，然而角膜接触镜为暂住的细菌提供了黏附表面，其在接触镜表面可形成生物膜，成熟的生物膜可间歇地释放细菌以及细菌产物，如内毒素或外毒素等损伤角膜上皮，从而导致角膜炎的发生[16]。与此同时，铜绿假单胞菌产生的碱性蛋白酶、明胶酶，以及其侵入角膜上皮的能力对此类角膜炎的发病亦起了重要作用[17]。

目前全球约有上亿的隐形眼镜佩戴者。在全球市场中，为延长配戴时间，多使用硅水凝胶镜片作为主要隐形眼镜镜片类型。然而，这些高分子材料的引入也没有解决由其导致的眼部感染和炎症问题，细菌性角膜炎的发病率并没有改变[18]。铜绿假单胞菌是配戴隐形眼镜引起细菌性角膜炎的主要致病菌，该菌有附着隐形眼镜并随后形成生物膜的能力，该生物膜延长了病原体与眼睛的表面接触，提高了其致病性[19,20]。

眼内炎是眼外伤或眼部手术如白内障等的常见并发症，细菌进入眼组织后可形成生物膜，对滴眼剂的耐药性增强，并能抵御机体免疫系统对细菌的清除作用。

4 抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的研究进展

眼部微生物膜形成后对各类抗生素滴眼液及眼膏的耐药性增强，且易抵抗机体免疫系统对微生物的清除。目前，针对一些抑制生物膜形成的药物的研究受到广泛重视，研究显示[21]，大环内酯类药物克拉霉素与氟喹诺酮类药物加替沙星联用可有效清除大鼠肺部PA生物膜感染。具有抗菌作用的中药双黄连溶液与加替沙星联用对PA生物膜有明显抑制作用，而且两药有明显的协同作用[22]。此外，祛痰药盐酸氨溴索与阿米卡星联用，增强了阿米卡星对生物膜内PA的杀菌作用[23]。纳米银能阻碍铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌生物膜的形成[24]。研究显示[25]，环丙沙星、庆大霉素及氨苄西林单独应用对生物膜的清除效果有限，EDTA对生物膜有一定清除作用，当EDTA与抗生素联合作用时则对生物膜有显著杀菌作用，这是因为EDTA可以和细菌细胞外膜的脂多糖上的镁离子结合，促进脂多糖释放，从而增加细胞膜的通透性，有利于抗菌药渗入胞内发挥作用。这将有助于改变临床上铜绿假单胞菌对多种抗生素的耐药情况。

最近的研究表明[26]，噬菌体能产生多糖解聚酶降解细菌胞外多糖，4种铜绿假单胞菌敏感药物(庆大霉素、环丙沙星、加替沙星、头孢他啶)对经噬菌体作用后的铜绿假单胞菌的敏感度均有不同程度的提高，说明噬菌体产生的多糖解聚酶有利于抗菌素通透细菌的生物膜，有协同抗菌作用。

对铜绿假单胞菌生物膜的生物学研究将有助于对眼部感染和眼部非生物性材料植入导致的细菌感染提供新的治疗方法。

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R446.5,R378.99+1

A

1674-1129(2013)05-0471-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.026

陈薇婴，女，汉族，1966年5月23日出生，毕业于天津医科大学检验系，学士学位，主管技师，主要研究方向为眼科微生物感染。

关禹博，男，汉族，1965年6月18日出生，毕业于天津医科大学医疗系,学士学位，副主任医师，主要研究方向为视网膜脱离及眼底病。