PCR-SSP法在ABO疑难血型鉴定中的应用

肖莉，后平钦，李国良

(江西省血液中心,江西南昌330077)

PCR-SSP法在ABO疑难血型鉴定中的应用

肖莉，后平钦，李国良

(江西省血液中心,江西南昌330077)

目的采用PCR-SSP法检测ABO基因型。方法ABO血型血清学正反定型不符样本10个，用PCR-SSP法检测其基因型。结果10个疑难血型标本PCR-SSP法均得出明确的ABO血型结果。结论PCR-SSP法检测ABO血型方法可靠，可应用于临床输血。

ABO血型；ABO血型基因型；PCR-SSP

1900年由Landsteiner发现的ABO血型系统在临床输血中具有极其重要的意义。ABO血型的标准血清学正反定型方法，因具有简单实用的特点而得到推广和普及，但血清学试验亦存在局限性，受生理、病理等诸多因素的影响可导致正反定型不符。而基因分型方法在某些程度上克服了血清学试验的弱点，可以作为血清学方法的有益补充，为临床输血以及法医中亲子鉴定、个体识别提供强有力的检测手段[1]。本实验采用PCR-SSP法对ABO正反定型不符的标本作基因分型，报告如下。

1 材料与方法

1.1 对象本实验室和各大医院送检的血清学ABO正反定型不符，血型存在疑问的血样共10例。

1.2 血清学检测试剂与方法抗A、抗B标准血清、ABO试剂红细胞、筛选红细胞、谱细胞购自上海市血液中心。ABO血型鉴定采用试管法盐水正反定型，抗体筛选和抗体鉴定采用间接抗人球法。

1.3 标本的基本情况10个样本全是先正反定型不符，放至4℃以及放散试验均未得出结果。1号为高效价的冷集素和温抗体，3、4、9号为健康无偿献血者，5号为淋巴瘤患者，10号为血液病患者，6号为抗原减弱，2、7、8号为医院送来的正反定型不符标本。ABO血型检测血清学反应格局见表1。

1.4 DNA提取采用盐酸胍为基础的提取方法。盐酸胍溶液使细胞裂解，蛋白质变性，促进DNA与硅胶模结合，经过清洗和洗脱得到DNA。(由TBG公司提供)

表1 10例标本的血清学反应格局

1.5 扩增引物ABO血型基因引物由天津秀鹏生物技术开发有限公司提供。见表2。

表2 ABO基因引物PCR产物片段

1.6 总反应体系10μl 0.1μlTAq酶(5U/μl)，0.9μlDNA(30ng/μl)，9μldNTP-Buffer工作液。

1.7 PCR扩增使用美国PE9700型PCR扩增仪，扩增条件，96℃2min；96℃20s,68℃60s5个循环；96℃20s,65℃45s,72℃30s10个循环；96℃20s,62℃45s,72℃30s15个循环；72℃3min；4℃保存。

1.8 PCR扩增产物的检测将每个PCR反应产物(5～10μl)转移到2.5%的琼脂榶凝胶孔中，140～150V电泳15～20min，观察结果，根据是否产生特异性条带，并与结果分型表相比对，从而检出血型。

2 结果

2.1 PCR扩增产物电泳结果见图1。

图1 ABO基因扩增片段电泳图谱

2.2 样品基因型与血清学检测结果比较见表3。

表3 ABO基因检测结果与血清学检测结果相比较

3 讨论

ABO血型系统有A、B、O三个基因，基因组DNA长度约30Kb，位于9q34.1-9q34.2其核苷酸序列高度保守，ABO基因之间具有几个碱基替换或单个碱基缺失，他们具有高度的同源性。B基因在cDNA上的297、526、657、703、796、803、930位有7个核苷酸与A基因不同[2]，使其编码的B转移酶的特异性不同于A转移酶。O基因只是cDNA的第261位核苷酸不同，第261位胞嘧啶在O基因中的缺失，造成了O基因在261位后发生阅读框架的移动，形成了新的终止密码子，提前终止了转移酶的翻译，使其编码出的蛋白只有115个氨基酸，并且没有转移酶的催化功能[3]。

血清学方法鉴定ABO血型是通过检测血型抗原和抗体来去确定，疑难者再附加吸收放散试验、唾液定型等项目，而抗原、抗体在不同亚型或某些疾病会产生强弱变化影响血型的判断[4],这时结果判读的主观性较大，不同实验室甚至不同实验人员之间的结果可比性不强，试剂的质量对于鉴定结果有决定性影响等[5,6]。DNA不受上述因素的影响，ABO基因座位由7个外显子组成，决定A、B转移酶特异性的是第4、7外显子编码的氨基酸序列，迄今，已发现有30多种ABO亚型基因序列[7]，这些具有序列多态性的等位基因构成了ABO血型分子生物学分型的基础[8]。PCR-SSP技术检测ABO血型基因型是利用ABO基因发生突变位点的不同核苷酸，分别设计一系列序列特异性引物，直接扩增ABO血型基因DNA片段从而测得ABO血型及其亚型[9]。PCR-SSP法与血清学方法相比，克服了血清学鉴定只能鉴定表现型的局限，标本1、5、10号不受疾病的影响；其它标本血清学的假凝集、弱凝集现象血型鉴定均得到快速解决。患者经基因检验确定血型，给予同型血输注治疗取得满意效果。

总之，用PCR-SSP法检测血型方法可靠，并可精确到亚型，避免了结果误差，对指导临床诊断处理提供了理论依据。

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R457.1+1

A

1674-1129(2013)05-0444-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.014

江西省卫生厅资助项目(编号20073179)

肖莉，女，1975年5月，毕业于南昌大学医学院，学士学位，副主任技师，主要从事输血医学研究。

李国良，男，1968年6月生，硕士学位，主任医师，主要从事输血医学研究