H7N9禽流感病毒感染及其实验室诊断

董晓毅，孙长贵

(解放军117医院检验科南京军区医学检验质量控制中心，浙江杭州310013)

·述评·

H7N9禽流感病毒感染及其实验室诊断

董晓毅，孙长贵

(解放军117医院检验科南京军区医学检验质量控制中心，浙江杭州310013)

至2013年4月23日，新型H7N9亚型的禽流感病毒已经在中国感染了108人，并致22人死亡。科学家发现甲型禽流感病毒H7N9源自3种病毒株的重配，并出现了实质性的突变。H7N9病毒拥有几个哺乳动物流感病毒的特征，从而形成了对人类的感染力，因此需重视其大规模流行的潜力。本文对该病毒的生物学特性、流行病学、临床表现和实验室诊断进行了简要综述。

H7N9；禽流感病毒；感染

中国国家卫生和计划生育委员会于3月31日首次通报，上海市和安徽省发现3例人感染H7N9禽流感病例。H7N9禽流感是由新亚型H7N9禽流感病毒引起，该病毒是全球首次发现，因其是一种新亚型，起病急、进展快、致死率高，受到广泛关注。目前对H7N9禽流感病毒的研究仍处于起步阶段，本文对近期国内有关H7N9禽流感病毒的生物学特性、流行病学、临床表现和实验室诊断等方面的研究进展作简要综述。

1 H7N9禽流感病毒的生物学特性

H7N9是禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)的一个亚型，AIV属于正黏病毒科(orthomyxoviridae)甲型流感病毒属，是引起禽流行性感冒的病原体。AIV表面有钉状的血细胞凝集素(hemagglutinin，HA)和蘑菇状的神经氨酸酶(neuraminidase，NA)两种糖蛋白，根据HA和NA的抗原性差异，可将AIV分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。H7N9就是其中一种，在2013年以前，H7N9仅感染禽类，并未发现过感染人的情况[1]。

禽流感病毒普遍对热敏感，对低温抵抗力较强，65℃加热30min或煮沸(100℃)2min以上可灭活。病毒在较低温度粪便中可存活1周，在4℃水中可存活1个月，对酸性环境有一定抵抗力，在pH4.0的条件下也具有一定的存活能力。在有甘油存在的情况下可保持活力1年以上[2]。

2 H7N9禽流感病毒的分子进化

AIV基因组由8个分节段单股负链RNA组成，编码8种结构蛋白(HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA)和2种非结构蛋白(NS1和NS2)。有关新型H7N9病毒的起源、进化和感染途径等大多数信息，均来自于对已发现的H7N9病毒基因组序列的分析、比对和推断。

中国杭州疾病预防控制中心和WHO中国流感中心共采集和分析了4个新H7N9甲型禽流感病毒的基因组，并提交GISAID数据库，分别为A/ Shanghai/1/2013、A/Shanghai/2/2013、A/Anhui/1/2013和A/Hongzhou/1/2013(数据不全，仅有HA、NA和M)，样本均来源于人类患者[3-6]。

在核苷酸和氨基酸水平上，所有4个新H7N9甲型禽流感病毒的序列都高度相似，提示其来源

于同一个祖先。它们的HA基因属于禽流感病毒的欧亚谱系，与1株2011年分离自浙江省鸭群的H7N3病毒的基因序列相似度最高，为95%。新病毒的NA基因则与1株2010年分离自捷克的野鸭的H11N9相似度最高，为96%，另外1株相似度最高的NA基因来源于韩国野鸟的H7N9病毒。其余6个基因则均与H9N2病毒基因高度相似(97%)[3-5]。H9N2亚型已在东亚地区循环了很多年，其跨种感染人的机制刚刚得到证实：H9N2亚型可感染人肺组织，主要的靶细胞为Ⅱ型肺泡细胞、呼吸细支气管上皮细胞和细支气管上皮细胞，并可在人肺上皮细胞中有效复制[7]。由此可以推断，新型的H7N9病毒并非来源于旧有的H7N9病毒，而更可能是一种新型的三联重配体，即由3种不同的禽流感病毒重配而成，而重配地点可能就在我国的东部长三角地区[4,5]。重配而成的H7N9拥有了感染人类的能力。

在核酸水平上，A/Shanghai/2/2013,A/Anhui/1/ 2013和A/Hangzhou/1/2013三者核苷酸序列高度相似(99%)，而A/Shanghai/1/2013与众不同，它与A/Shanghai/2/2013的核苷酸序列相差达52个核苷酸，提示A/Shanghai/1/2013与其它新H7N9病毒来源不同[3-5]。

另外，HA受体结合位点的氨基酸序列决定了对人类或禽类的偏好性，对H7N9序列分析中发现的几种突变，如A138S、Q226L、G186V等，都可增加H5、H7病毒与人类受体的结合能力。而位于150-loop的T160A突变，也可导致N-糖基化位点的缺失，最终造成病毒对人类受体结合能力的增加[5]。

在PB2蛋白627位的赖氨酸是禽流感病毒能在哺乳动物中有效复制的重要标志，曾在高致病性H5N1和H7N7中检测到，而在H9N2病毒中比较罕见，在4株新H7N9病毒中，均发现了该PB2-627K突变[3-5]。在NA蛋白的茎区，4种新H7N9病毒均观察到了69～73位氨基酸的删除，这种现象过去曾发生在病毒适应陆生鸟类的案例中，提示H7N9病毒在感染人之前可能在陆生禽类中循环[5]。

总之，从生物进化的角度看，新发现的4种H7N9病毒已经携带了若干哺乳动物流感病毒的特征，其潜在的流行能力需要引起关注[5,6]。

3 流行病学

H7亚型的AIVs可分为北美谱系和欧亚谱系，其感染人的第一次报道发生于1959年，美国一名男性肝炎患者血液中分离到了H7N7病毒。1996年，又从美国一名患结膜炎的女性体内分离到禽源的H7N7。2003年以前，H7亚型感染人的报道很少，一般为实验室感染[1]。在欧亚谱系，2003年春天，荷兰发生了人群中大规模的H7N7亚型感染，导致86人感染。症状主要为结膜炎[1]。

最近暴发的H7N9禽流感病毒疫情，始于3月31日3例人感染H7N9的报道，患者均出现严重的肺炎和急性呼吸窘迫综合症(ARDS)[3,6]，至4月23日，全国共报告108例确诊病例，分布于北京(1例)、上海(33例，死亡12例)、江苏(24例，死亡3例)、浙江(42例，死亡6例)、安徽(4例，死亡1例)、山东(1例)、河南(3例)7省市。目前病例处于散发状态，尚未发现人传人的证据。

3.1 传染源目前已经在禽类及其分泌物或排泄物分离出H7N9禽流感病毒，与人感染H7N9禽流感病毒高度同源，传染源可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类。目前已发现2例家庭聚集性病例，一宗为首批报告确诊感染H7N9的87岁患者家庭，另一宗是一对夫妻先后被确诊为感染H7N9的家庭，但这些证据仍不足以代表H7N9病毒已经具有了人传人的能力。

3.2 传播途径经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物，或直接接触病毒感染。

3.3 高危人群在发病前1周内接触过禽类者，例如从事禽类养殖、贩运、销售、宰杀、加工业等人员。

4 临床表现

中国国家卫生和计划生育委员会2013年4月3日印发人感染H7N9禽流感诊疗方案(2013年第1版)、防控方案及医院感染预防与控制技术指南。并于2013年4月10日再次发布人感染H7N9禽流感诊疗方案(2013年第2版)，以指导禽流感的诊断和防治。根据该方案，流感的潜伏期及现有H7N9禽流感病毒感染病例的调查结果，潜伏期一般为7d以内。

患者一般表现为流感样症状，如发热、咳嗽、少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，多在5～7d天出现重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，呼吸困难，可伴有咯血

痰；可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、感染性休克，甚至多器官功能障碍，部分患者可出现纵隔气肿、胸腔积液等[2]。

5 实验室检查[2]

5.1 血常规白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，可有血小板降低。

5.2 血生化检查多有肌酸激酶、乳酸脱氢酶、天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶升高，C反应蛋白升高，肌红蛋白可升高。

5.3 病原学及相关检测对于H7N9病毒的检测，目前主要是通过反转录PCR方法检测病毒RNA。由于核酸检测是直接检测病原体RNA，具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点，为疾病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。相关试剂盒研制难度较低，目前已有文献报道使用实时荧光逆转录聚合酶链反应(real-time reverse-transcription polymerase chain reaction，real time RT-PCR)检测H7N9病毒[8]。

诊疗方案要求，抗病毒治疗之前必须采集呼吸道标本送检(如鼻咽分泌物、口腔含漱液、气管吸出物或呼吸道上皮细胞)。有病原学检测条件的医疗机构应尽快检测，无病原学检测条件的医疗机构应留取标本送指定机构检测。

5.3.1 甲型流感病毒抗原筛查呼吸道标本甲型流感病毒抗原快速检测阳性。但仅可作为初筛实验。

5.3.2 核酸检测对患者呼吸道标本采用real time RT-PCR检测H7N9禽流感病毒核酸。real time RT-PCR检测H7N9禽流感病毒和甲型流感病毒通用引物和探针见表1[9]。

表1 real time RT-PCR检测H7N9禽流感病毒和甲型流感病毒通用引物和探针

5.3.3 病毒分离从患者呼吸道标本中分离H7N9禽流感病毒。

5.3.4 动态检测双份血清H7N9禽流感病毒特异性抗体水平呈4倍或以上升高[2]。

6 诊断与鉴别诊断[2]

6.1 诊断根据流行病学接触史、临床表现及实验室检查结果，可作出人感染H7N9禽流感的诊断。在流行病学史不详的情况下，根据临床表现、辅助检查和实验室检测结果，特别是从患者呼吸道分泌物标本中分离出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸检测阳性，或动态检测双份血清H7N9禽流感病毒特异性抗体水平呈4倍或以上升高，可作出人感染H7N9禽流感的诊断[2]。

6.1.1 流行病学史发病前1周内与禽类及其分泌物、排泄物等有接触史。

6.1.2 诊断标准

6.1.2.1 疑似病例符合上述临床表现，甲型流感病毒抗原阳性，或有流行病学接触史。

6.1.2.2 确诊病例符合上述临床表现，或流行病学接触史，并且呼吸道分泌物标本中分离出H7N9禽流感病毒或H7N9禽流感病毒核酸检测阳性或动态检测双份血清H7N9禽流行病毒特异性抗体水平呈4倍或以上升高。

6.2 鉴别诊断应注意与人感染高致病性H5N1禽流感、季节性流行感(含甲型H1N1流感)、细菌性肺炎、传染性非典型肺炎(SARS)、新型冠状病毒肺炎、腺病毒肺炎、衣原体肺炎、支原体肺炎等疾病进行鉴别诊断。鉴别诊断主要依靠病原学检查。

7 结束语

目前，针对H7N9禽流感病毒的研究已经获得了一定的成果，为下一步更有效地防控流感大流行提供了大量信息，但对于其病毒进化、传播途径、致病机制和流行规律等方面还了解不多和不深，需要进一步地深入研究。

[1]朱闻斐,高荣保,王大燕,等.H7亚型禽流感病毒概述[J].病毒学报, 2013,29(3):245-249.

[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.人感染H7N9禽流感诊疗方案[S].第2版.2013.

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[4]He J,Ning L,Tong Y.Origins and evolutionary genomics of the novel 2013 avian-origin H7N9 influenza A virus in China:Early findings[EB/OL].arXiv:1304.1985v2[2013-04-09].

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[9]WHO.Real-time RT-PCR Protocol for the Detection of Avian Influenza A(H7N9)Virus Real-time RT-PCR Protocol for the Detection of Avian Influenza A(H7N9)Virus[S].http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/cnic_realtime_rt_pcr_protocol_a_h7n9.pdf.

Infections and laboratory diagnosis of H7N9 avian influenza

DONG Xiaoyi,SUN Changgui.Department of Clinical Laboratory, 117th Hospital of PLA，Hangzhou 310013,China

Novel avian influenza virus of the H7N9 subtype has infected 108 and killed 21 people in China as of April 23, 2013.Scientists have found that the influenza A(H7N9)virus was derived from a reassortment of 3 strains of AIV,and substantial mutations have been detected.These influenza A(H7N9)virus possess several characteristic features of mammalian influenza viruses,which are likely to contribute to their ability to infect humans and raise concerns regarding their pandemic potential.This paper briefly reviews recent progress in the biological characterization,epidemiology,clinical manifestation and laboratory diagnosis of this highly virulent virus.

H7N9;Avian influenza virus;Infection

R511.7,R373.1+3

A

1674-1129(2013)02-0105-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.02.001

董晓毅，男，1974年生，主管技师，博士，从事临床微生物学检验。

孙长贵,硕士研究生导师，主任技师，教授,suncgui@163. com