以PTPN12为靶点的肝癌生物靶向治疗初探

朱蓓

（泰州职业技术学院医学技术学院，江苏 泰州 225300）

以PTPN12为靶点的肝癌生物靶向治疗初探

朱蓓

（泰州职业技术学院医学技术学院，江苏 泰州 225300）

目的探讨抑癌基因PTPN12在肝癌细胞系Hep-G2中生物治疗肝癌的效果，揭示PTPN12在临床应用上的潜在意义。方法在Hep-G2细胞中顺转、稳定转染PTPN12基因后，通过MTT、Western Blot、荧光定量PCR分析抗肿瘤作用。结果转染PTPN12后的Hep-G2细胞增殖慢，凋亡率高，PTPN12蛋白表达量高。结论PTPN12基因在肝癌表达上调，能有效抑制肿瘤细胞的生长，从而促进肿瘤细胞的凋亡。因此，以PTPN12为靶点开展生物治疗可能是一种新的治疗手段。

PTPN12；生物治疗；肝癌

肝癌是我国十大恶性肿瘤之一，严重伤害国民身体健康[1]。近年来，随着对肝癌发生、发展、转移、侵袭等过程的深入研究，一些新的治疗手段和药物被引入到肝癌治疗中，如生物治疗、细胞治疗、靶点药物等[2-3]。PTPN12是一种重要的抑癌基因，属于酪氨酸磷酸酯酶家族，能正向调节RAS等通路[4-5]。PTPN12在乳腺癌中能抑制乳腺上皮增殖和转化，抑制恶性肿瘤发生和转移，同时能抑制多种原癌酪氨酸激酶(包含HER2和EGFR等)[6]。本研究旨在探索PTPN12在肝癌中的抗肿瘤机制和以其为靶点的生物治疗的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 Hep-G2细胞系购自ATCC；pcDNA3.1质粒(购自Invitrogen)；转染试剂Fugene HD、G418(均购自Roche)；DMEM高糖培养基、胎牛血清(购自Gibco，Invitrogen)；RNA抽提试剂、反转录试剂、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(购自Roche)。

1.2 实验方法

1.2.1 Hep-G2培养 Hep-G2细胞在37℃，5% CO2浓度下用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基进行培养。

1.2.2 稳定转染PTPN12基因 根据NCBI中 PNPT12的mRNA序列(序列号：NM_002835.2)，在三阴性乳腺癌组织中扩增其基因全场，并亚克隆至pcDNA3.1载体中。所提取的质粒与转染试剂Fugene HD的用量比例为2 μg：9 μl，进行转染。顺转2 d后，收集一部分转染细胞，另一部分转染细胞中添加G418进行稳定转染筛选。

1.2.3 MTT和AO/EB检测 将上述所收集的细胞添加至6孔板和96孔板后，分别在培养24 h和48 h后吸取培养基和磷酸盐缓冲剂(PBS)清洗，加入10 μl噻唑蓝(MTT)染料，37℃孵育4 h，然后加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)，再于37℃孵育5 min，酶标仪570 nm处检测。同时，进行AO/EB双染色，观察Hep-G2细胞的凋亡变化。

1.2.4 荧光定量RT-PCR、Western Blot分析凋亡相关基因转录和翻译水平表达量 在6孔板中提取正常和转染PTPN12后的Hep-G2细胞总RNA，在检测RNA的完整性后进行反转录及荧光定量RT-PCR检测。荧光定量RT-PCR实验条件：94°C 30 s，60°C 40 s，40个循环，并在60°C下收集荧光。表1为所用引物序列。对6孔板中的细胞进行蛋白提取(按照Roche产品说明书进行操作)，在获得蛋白后，通过BCA蛋白定量试剂盒对其进行定量。随后，进行Western Blot检测PTPN12和β-actin蛋白变化。

表1 所用引物名称及引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行处理，计量资料组间比较采用配对t检测分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hep-G2细胞中转染PTPN12促进Hep-G2细胞进入凋亡 Hep-G2细胞在经PTPN12转染后通过MTT检测细胞增殖(图1)：转染后的Hep-G2细胞其增殖明显放慢，低于正常Hela细胞。而AO/EB染色固定后的Hep-G2细胞则反映出细胞的凋亡情况，转染PTPN12后的Hep-G2细胞其凋亡率最高。

图1 Hep-G2细胞PTPN12转染前、后增殖情况

2.2 Hep-G2细胞中稳定转染 PTPN12后PTPN12基因mRNA和蛋白表达水平 转染PTPN12后的Hep-G2细胞、正常Hela细胞的PTPN12基因表达量如图2所示。上述两种细胞的PTPN12蛋白表达量如图3所示。

图2 PTPN12转染Hep-G2细胞后PTPN12基因表达变化

图3 PTPN12转染Hep-G2细胞后PTPN12蛋白表达变化

3 讨论

PTPN12是近年来颇受关注的一个新型抑癌基因，其在细胞分化、转移、增殖等方面具有重要作用，也与酪氨酸磷酸化具有关键作用[7]。PTPN12属于蛋白酪氨酸磷酸化家族，其在大脑等多种组织中具有高表达，其抑制肿瘤的作用则是通过MAPK去磷酸化来实现。除此以外，PTPN12还参与到细胞骨架和信号蛋白途径中，例如小GTP酶、FAK、CAS等[8-9]。虽然发现PTPN12在治疗三阴性乳腺癌中具有明显的作用，但是其抗肿瘤机制目前还不是完全清楚。本文旨在研究其在肝癌细胞系Hep-G2中的可能的抗肿瘤应用。

本文研究发现在转染PTPN12基因后，Hep-G2细胞的凋亡率明显增加，且凋亡率的增加幅度明显。这揭示了以PTPN12作为靶点的生物治疗途径可能成为一种新的治疗肝癌方法。

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Bio-therapy effect of PTPN12 on liver cancer.

ZHU Bei.School of Medical Technology,Taizhou Polytechnic College, Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect of PTPN12 in Hep-G2 cells,and to reveals the hidden meaning of PTPN12 in the clinical application.MethodsThe PTPN12 gene was transfected into Hep-G2 cells,and then the anti-tumor effect was analyzed by Real-time RT-PCR,Western Blot,and MTT.ResultsIncreasing PTPN12 expression in Hep-G2 cells were observed.The proliferation of Hep-G2 cells was inhibited,and the apoptosis rate was high.ConclusionPTPN12 may be a novel strategy for bio-therapeutic regents in liver cancer,which can effectively inhibit the growth of tumor cells and promote apoptosis.

PTPN12;Bio-therapy;Liver cancer

R735.7

A

1003—6350（2013）09—1264—02

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0534

朱 蓓。E-mail：pigbaby1577@sina.com

2012-11-21)

·论 著·