鱼源小肠结肠炎耶尔森菌5种毒力基因的检测和分析

王 利，苟小兰

（西南民族大学生命科学与技术学院 动物遗传育种学国家民委－教育部重点实验室，四川 成都 610041）

小肠结肠炎耶尔森菌（Yersiniaenterocolitica）属于耶尔森菌属，肠杆菌科。小肠结肠炎耶尔森菌广泛存在于自然界中，是人、畜、鱼等共患的致病菌，可引发人和动物患胃肠炎和腹泻，还可引起关节炎、结节性红斑，严重时可引起败血症，造成死亡。从20世纪80年代开始，研究者用体外法测定小肠结肠炎耶尔森菌的毒力以代替昂贵的动物试验。体外法主要包括：小肠结肠炎耶尔森菌的自凝性、血清抵抗性和毒力质粒的测定等［1－2］。至今为止，对小肠结肠炎耶尔森菌的毒力的研究已经取得了一些进展［3－4］。对其致病机制有了初步的认识，但仍有许多的问题有待深入研究。随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（PCR）已经用于检测小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因，迅速对该菌进行毒力鉴定，甚至在毒力质粒丢失后仍然可以预测该菌的致病力［5］。本试验采用PCR方法检测和分析了鱼源小肠结肠炎耶尔森菌5种重要的毒力基因：毒力活化因子基因（vir F）、粘附素基因（yad A）、粘附侵袭位点基因（ail）、毒力岛基因（HPI-int）和耐热肠毒素基因（ystB）。这有利于为深入探讨鱼源小肠结肠炎耶尔森菌的毒力和致病性积累科学资料。

1 材料与方法

1.1 菌种来源 小肠结肠炎耶尔森菌分离自四川某胭脂鱼养殖场，以甘油菌的形式保存于本实验室－80℃冰箱，备用。

1.2 主要试剂 改良Y培养基和CIN-1培养基，购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自TIANGEN BIOTECH（BEIJING）；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker（2000）等，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计 参考文献［6］，设计小肠结肠炎耶尔森菌5对毒力基因（ail、yad A、virF、ystB和 HPI－int）的引物，详细见表1。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 5对毒力基因引物序列

1.3.2 DNA模板制备 采用两种方法制备小肠结肠炎耶尔森菌DNA模板。第一方法是煮沸法，主要步骤是：取营养平板上生长的单个菌落加入含50μL dd H2O的1.5 m L离心管中，混匀后放入－80℃冰箱中过夜，取出后立即放入沸水中煮10 min，12 000 r／min离心5 min，取上清液作为模板，－20℃冻存备用。第二种方法是用细菌基因组DNA提取试剂盒，具体步骤参照试剂盒说明书进行。

1.3.3 PCR反应 PCR反应的体系：dd H2O 8.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5μL，上游引物和下游引物（浓度均为10μmol／L）各1μL，模板DNA 2 μL，共25μL。ail和HPI-int毒力基因PCR扩增反应条件为：94℃5 min；94℃60 s，50℃60 s，72℃60 s，35个循环，72℃10 min。virF毒力基因PCR扩增反应条件为：94℃5 min；94℃60 s，48℃60 s，72℃60 s，35个循环，72℃10 min。另外，两种毒力基因（ystB和yad A）则采用梯度PCR反应进行优化：94℃5 min；94℃60 s，退火温度分别为45℃、50℃、55℃和60℃，35个循环，72℃10 min。PCR结束后，取PCR产物5μL，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，80V电压，电泳30 min，凝胶成像仪下拍照。

1.3.4 HPI-int基因测序和序列分析 HPI-int基因PCR反应采用50μL体系：dd H2O 17μL，2×TaqPCR Master Mix 25μL，上游引物和下游引物（浓度均为10μmol／L）各2μL，模板DNA 4μL。PCR扩增反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 60 s，50℃ 60 s，72℃60 s，35个循环，72℃10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，检测出单一条带后，送交上海生工生物工程技术服务有限公司，采用ABI3730测序仪进行正反向测序。所得序列提交到NCBI的GenBank数据库，并采用生物信息学软件DNAStar和Blastn等对该序列进行分析。

2 结果

2.1 毒力基因检测 分别用两种方法制备的DNA作为模板，用PCR方法检测小肠结肠炎耶尔森菌5种毒力基因（ail、yad A、virF、ystB和 HPI-int），得到的结果相似，无明显差异。ail基因目的条带大小约为351 bp，HPI-int基因条带大小约为714 bp，而virF基因目的条带大小约为561 bp，这3种基因所得的PCR扩增产物大小与试验预期结果一致，结果详见图1。另外两种基因（ystB和yad A）在反复优化PCR条件后都未扩增出目的条带，表明该菌株未携带ystB和yad A这两种毒力基因。

图1 毒力基因的扩增1：ail；2：HPI-int；3：yad A；4：vir F；5：ystB；M：DNA Marker分子量

2.2 HPI-int基因序列分析 HPI-int基因分别使用正反向引物测序，采用DNAStar软件中的Seqman对正反向序列进行组装、拼接，最终所得序列长度为722 bp，将该序列提交到 NCBI，GenBank序列号为JX041513。采用NCBI的Blastn工具对该序列进行比对，结果显示，该序列与小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛基因（Yersiniaenterocoliticaleft arm of the highpathogenicity island Score，GenBank 序 列 号 为AJ132668.1）序列的相似性为99% （705／710），因此表明HPI-int基因的测序结果和预期相符合。

3 讨论

耶尔森菌的致病因素主要包括：毒力质粒编码的分泌系统、外膜蛋白、侵袭性与毒素、铁摄取系统和超抗原等方面［7］。致病性小肠结肠炎耶尔森菌的致病因素主要是该菌所具有的特殊染色体基因、毒力质粒和菌毛。ail、HPI-int、yst A、ystB和 HPI毒力基因位于染色体上，而yad A和virF毒力基因位于质粒上。致病性的耶尔森菌可分为低致病性和高致病性两类。这种分类与染色体上是否携带有 HPI毒力岛有关，因为HPI是高毒力细菌表型表达的必需条件。这个染色体上的片段涉及生物合成、调节和耶尔森菌含铁铁载体的转运作用。在小肠结肠炎耶尔森菌中，毒力岛只出现于高致病性的小肠结肠炎耶尔森菌生物1B型 ，而低致病性的则无［4］。

至今为止，对小肠结肠炎耶尔森菌的毒力基因已经进行了一些研究［8－9］。典型的致病性小肠结肠炎耶尔森菌携带ail、yst A、yad A基因和virF毒力基因。致病性菌株不携带ystB，而非致病性菌株不携带ail、yst A、yad A、vir F。ystB主要为生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌携带的编码一种性质类似于yst A的耐热性肠毒素。ystB仅存在于生物1A型的菌株，而且在这个生物型中，目前资料表明这类菌株通常都是非致病性菌株。81株生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌均未检测出ail、virF、yst A基因和ystC基因［10］。王鑫等（2005）运用PCR和DNA探针杂交方法检测了致病性和非致病性小肠结肠炎耶尔森菌携带的ystB基因［11］。48株致病性小肠结肠炎耶尔森菌均不携带该基因。98株非致病性小肠结肠炎耶尔森菌中有52株携带ystB基因，占53.06%。这表明ystB基因仅存在于部分生物1A型非致病性小肠结肠炎耶尔森菌，而不存在于致病性菌株中。以上多个研究结果基本一致。本试验通过多次优化PCR条件也未检测出ystB基因，这提示该菌株很可能为致病性小肠结肠炎耶尔森菌。

裴耀文等（2011）发现3株致病性小肠结肠炎耶尔森菌株的毒力基因检测中均表现为ail和yst A阳性，而yad A、virF毒力基因缺失［12］。吉林省致病性小肠结肠炎耶尔森菌血清型毒力基因的分布情况表明，血清型O：3和O：9小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因的分布主要为ail＋、yst A＋、ystB－、yad A＋、virF＋型，其次是ail＋、yst A＋、ystB－、yad A－、vir F－型［13］。南京地区不同来源的123株小肠结肠炎耶尔森菌致病生物型菌株，均包含染色体上的毒力基因ail［14］。因此，ail与致病生物型之间存在明显关联。Zheng等（2008）用PCR方法检测了从腹泻病人粪便中分离出160株致病性小肠结肠炎耶尔森菌的毒力基因。检出率分别 为：ail（94%）、inv（100%）、yst A （93%）、ystB（7.5%）、ystC（5%）、yad A（89%）和virF（82%）［5］。该结果表明，并非所有的致病性小肠结肠炎耶尔森菌都携带了能引起疾病的染色体和质粒上的全部毒力基因。由此推测，其中一些缺乏某种毒力基因的菌株可能具有其他的、未知的毒力标记，从而在致病性小肠结肠炎耶尔森菌的多种发病机理中发挥着重要的作用。以上报道的结果存在一些较小的差异，可能是由于不同地区、不同菌株的差异或毒力基因的检测片段的差异等原因。

本试验中检测出了ail、vir F和HPI-int，而未检测到yad A，这与以上报道基本相一致。这也提示该菌具有致病性。HPI-int基因的测序结果分析表明，该序列与小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛基因的相似性达到99%，从而验证了本试验HPI-int基因检测的正确性，也进一步说明该菌株具有较强的致病性。yad A基因未被检出到可能是由于该基因位于质粒上，在实验室分离培养过程中菌株多次传代及长时间平板上保存后都很容易丢失质粒。质粒上的毒力基因与致病生物型之间的关联性要略低一些，因此依赖于质粒毒力基因检测通常是存在较大误差。致病性耶尔森菌遗传背景复杂，染色体DNA指纹分析具有多态性。在检测细菌毒力基因时必须检测染色体上的毒力因子，不能仅用毒力质粒的检测。选择染色体上的毒力基因时可优先选择ail基因，同时实验室应避免质粒丢失而使有毒株被误判为无毒株。综上所述，本试验运用PCR方法检测了小肠结肠炎耶尔森菌株的5种毒力基因。本菌株检测并分析了染色体上的毒力岛（HPI-int）基因，因此推测它是强毒力株，具有较强的致病性。下一步，将进行本菌株对多种鱼类的致病性试验，深入研究该菌株的毒性及其危害。

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