食品动物源沙门菌aac（6′）-Ib-cr基因检测

林居纯，覃春红，赖 婧，舒 刚，吴聪明

（1.四川农业大学动物医学院，四川 雅安 625014；2.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193）

氨基糖苷类药物是临床上使用最为古老药物之一，随着药物广泛使用，细菌对该类药物耐药性日趋严重［1－2］。以往研究显示，细菌产生修饰酶是导致耐药性产生主要机制［3］。氨基糖苷类修饰酶按功能可分成乙酰转移酶（AAC）、磷转移酶（APH）、核苷转移酶（ANT）。而AAC（6，）是自然界中重要的氨基糖苷类修饰酶，AAC（6′）-Ib是其中最常见的，赋予细菌对氨基糖苷类耐药。近年来，aac（6，）-Ib突变体aac（6′）-Ib-cr成为了研究热点。aac（6′）-Ib-cr基因编码让氨基糖苷类和喹诺酮类两种不同药物发生乙酰化修饰的修饰酶。aac（6′）-Ib-cr基因的发现改变了之前认为细菌不产生破坏喹诺酮类结构酶观点，为细菌耐喹诺酮类药物分子机制研究开辟了新途径。尽管aac（6′）-Ib-cr介导低水平喹诺酮类耐药，但可增加染色体选择性突变频率。如果环境中存在有利于耐药性诱导和耐药基因传播条件，势必加重该耐药基因迅速传播和流行［4－5］。为了解食品动物源沙门菌中aac（6′）-Ib-cr基因流行状况，本次研究对316株食品动物源沙门菌进行了该基因检测。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 316株沙门菌自2003年至2010年间，从四川、河南、江苏、广东、江西省不同养殖场采集临床样本中分离得到。所有菌株经生化、血清型鉴定为沙门菌，其中鸡白痢沙门菌186株，菲利斯河沙门菌25株，吉韦沙门菌25株，科森沙门菌1株，肠炎沙门菌1株，沙拉姆沙门菌1株，卡杜纳沙门菌1株，默尔斯沙门菌1株，布雷得尼沙门菌1株，伊鲁根沙门菌1株，鸭沙门菌1株，布伦登卢普沙门菌3株，粗糙型沙门菌69株。质控菌鸡白痢沙门菌标准菌株（10398），购自中国兽医药品监察所；大肠杆菌ATCC25922，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 沙门菌aac（6′）-Ib-cr的 PCR 检测 采用水煮沸法提取细菌DNA。aac（6′）-Ib基因引物参考文 献 设 计［5］，aac（6′）-Ib-F：5′-TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA-3′，aac（6′）-Ib-R：5′-CTCGAATGCCTGGCGTGTTT-3′，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；反应体系：模板DNA 2（μL），上、下游引物10（μmol／L）各1（μL），10×TaqBuffer（Mg＋plus）5（μL），d NTP Mixture（各2.5 mmol／L）4（μL），Ta KaRa公司 ExTaq（5 U／μL）0.5（μL），灭菌超纯水加至50（μL）；PCR循环参数：（95℃，5 min）＋｛（94℃，30 s）＋（55℃，30 s）＋（72℃，45 s）｝×32＋（72℃，10min）。用Bst-CI酶对aac（6′）-Ib阳性PCR产物进行酶切消化试验，丢失酶切位点基因为aac（6′）-Ib-cr变异体［5］。随机挑选阳性菌株的靶基因PCR产物纯化后测序，测序结果与GenBank已知序列进行比对分析。

1.3 药物敏感性检测 用微量肉汤稀释法测定aac（6′）-Ib-cr阳性菌和阴性菌对链霉素（STR）、庆大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）、阿米卡星（AMI）、萘啶酸（NAL）、诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIP）、恩诺沙星（ENR）、氧氟沙星（OFL）、洛美沙星（LOM）10种药物的敏感性，根据CLSI要求进行药物敏感性判断［6］，鸡白痢沙门菌（10398）和大肠杆菌ATCC25922为质控菌。采用SAS 9.0软件包的FREQ 过程进行aac（6′）-Ib-cr阳性菌和阴性菌耐药率显著性检验。

1.4aac（6′）-Ib-cr阳性菌 PFGE 分子分型 PFGE分型按照美国疾病预防控制中心（CDC）推荐分型方案进行［7］。

2 结果

2.1aac（6′）-Ib-cr基因 检 测 316株 沙 门 菌 经aac（6′）-IbPCR 扩增和 BstCI酶切，结果有50株（15.82%）出现阳性。这50株阳性菌均为2007年～2010年间分离自四川省不同地区养殖场。不同食品动物源菌株aac（6′）-Ib-cr基因检出率可见，猪源、牛源菌株极显著高于鸡源、鸭源菌株（表1）。随机挑选5株阳性菌aac（6′）-Ib-crPCR 测序后，与GenBank序列号FJ594765序列比对，同源性均为98%。

表1 不同食品动物源菌株aac（6′）-Ib-cr基因检出情况

2.2 药敏试验结果 50株aac（6′）-Ib-cr阳性菌和266株阴性菌对链霉素等10种不同抗菌药物耐药率见表2。由表2可见，aac（6′）-Ib-cr阳性菌对链霉素等4种氨基糖苷类耐药率显著或极显著高于阴性菌组（P＜0.05或P＜0.01），但对喹诺酮类除奈啶酸显著高于阴性菌组外（P＜0.05），对环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星耐药率显著或极显著低于阴性菌组（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 aac（6′）-Ib-cr阴性菌和阳性菌株对不同药物耐药率比较 （%）

2.3 PFGE分型结果 50株阳性菌PFGE谱型为3类，其中25株吉韦沙门菌（S.Give）和菲利斯河沙门菌（S.Fyris）表现为两种PFGE谱型，1株雷得尼沙门菌（S.Bredeney）呈不同谱型。

3 讨论与结论

aac（6′）-Ib-cr编码的乙酰化酶，是世界上首次发现能同时导致氨基糖苷类和喹诺酮类两种药物失活的双功能酶，而且还能提高暴露于环丙沙星菌株发生染色体突变几率［5］。自2003年在中国上海第一次发现该基因后，其他国家和地区也相继出现aac（6′）-Ib-cr介导的耐药性［4］。本次研究在316株食品动物源沙门菌中检测到了50株菌（检出率15.82%）携带aac（6′）-Ib-cr基因，这些阳性菌株均分离自四川省不同养殖场。本次检出率远高于其他国家检出率［8－10］，这说明了在四川省食品动物源沙门菌中aac（6′）-Ib-cr分布较广。不同食品动物源菌株aac（6′）-Ib-cr基因检出率比较可见，牛和猪体内分离菌该基因检出率远高于禽源菌株，这可能是由于牛、猪生活周期长，用药量大和时间长，故对耐药基因诱导和选择性比生活周期短的禽类强。

本研究还发现aac（6′）-Ib-cr阳性菌对4种氨基糖苷类药耐药率显著或极显著高于阴性菌，但奇怪的是对诺氟沙星、洛美沙星耐药率与阴性菌无差异性，对环丙沙星、恩诺沙星和氧氟沙星均低于阴性菌。以上现象的出现，可能是由于aac（6′）-Ib-cr酶对氨基糖苷类和氟喹诺酮类的乙酰化作用不同所致。已有研究证明aac（6′）-Ib-cr酶对氨基糖苷类亲和力远远大于氟喹诺酮类，对氨基糖苷类乙酰化作用强于氟喹诺酮类，aac（6′）-Ib-cr基因只介导细菌对氟喹诺酮类低水平耐药［11］，此外，可能是aac（6′）-Ib-cr阴性菌中存在其他介导氟喹诺酮类耐药基因，而本次只检测了aac（6′）-Ib-c基因，故菌株是否携带aac（6′）-Ib-cr基因，对氟喹诺酮类的耐药性影响不及对氨基糖苷类。

PFGE检测发现，本次检测的50株aac（6′）-Ib-cr阳性菌只有3种谱型。同一血清型、但不同分离时间和不同食品动物源的沙门菌具有相同PFGE谱型，表明这些菌株在进化上可能是具有同源性较高的沙门菌克隆演变而成，同时也表明在不同时间、空间和动物间存在交叉感染。相同或不同PFGE谱型菌株均检出aac（6′）-Ib-cr，说明在本次分离的沙门菌中aac（6′）-Ib-cr基因在菌株间存在垂直传播和水平传播。

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