禽霍乱巴氏杆菌的分离鉴定与致病性研究

于成接，丁优玲，华亚峰，金梅林，张安定

（1．华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉430070；2．华中农业大学动物医学院，湖北 武汉430070）

禽巴氏杆菌病又称禽霍乱，是由多杀性巴氏杆菌所引起的鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类的一种出血性、败血性传染病。各种家禽、野禽对多杀性巴氏杆菌均易感染，发病率和死亡率高。该病主要通过呼吸道、消化道及皮肤外伤感染发病，导致禽霍乱。本病于四季都可发生流行，高温、多雨潮湿的环境易诱发。饲养管理不当，如断料、断水或突然改变饲料等，都可提高家禽对禽霍乱的易感性［1］。

2011年10月广西某鸡场发生产蛋鸡急性致死病例，发病率和死亡率都很高。有些病例病程非常短，不表现明显的临床症状即突然死亡，多数病鸡呈急性症状，病鸡精神沉郁，嗜睡，缩颈畏寒，羽毛松乱，食欲减少或不食，病鸡口鼻有浆液性、黏液性分泌物流出，并伴咳嗽症状，最后昏迷痉挛而死亡。使用青霉素、庆大霉素等多种抗生素拌料、饮水治疗无效，病情得不到控制，给养鸡场造成很大的经济损失。为了确诊该病，我们选取了4只死亡时间在2h以内的病死鸡，进行临床剖检、病原分离、鉴定以及致病性研究，确诊该病的病原为对鸡具有很高致病性的A型禽巴氏杆菌。

1 材料与方法

1．1 主要试剂 TSA，TSB均为BD公司产品；麦康凯琼脂购自杭州天和微生物试剂有限公司；无支原体新生牛血清，购自浙江天杭生物科技有限公司；TransTaq－T DNA Polymerase，dNTP，Trans2kPlus DNA Marker，购自北京全式金生物技术有限公司；DNA回收试剂盒，购自上海捷瑞生物工程有限公司；美蓝、瑞氏、革兰染料，均购自国药集团化学试剂有限公司，美蓝染液（每100mL染液含0．3g美蓝，30mL 95%乙醇，终浓度0．01%的 KOH），瑞氏染液（0．1g瑞氏粉末研磨溶解于60mL甲醇），载玻片，购自武汉博士德生物工程有限公司。其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

1．2 庆大霉素、复方新诺明、头孢拉定、卡那霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、链霉素、新霉素、环丙沙星、强力霉素、四环素、头孢曲松、克林霉素、氨苄青霉素、阿米卡星、万古霉素、阿奇霉素、林可霉素、阿莫西林、多黏菌素B、痢特灵、壮观霉素的药敏纸片，均购自杭州天和微生物制剂有限公司。

1．3 病鸡剖检 根据鸡的解剖结构特点及常规剖检步骤及方法进行。组织触片制作均在无菌超净工作台上操作，所有染色均参照兽医微生物学的方法进行［2］。

1．4 病原的分离培养 无菌采取病死鸡的心、肝、肺的组织液，均分别划线接种于TSA（含10%血清）平板培养基、麦康凯琼脂平板培养基37℃恒温箱培养，12h后观察。

1．5 药敏试验 用无菌棉拭纸蘸取菌液，于TSA（含10%血清）培养基表面均匀接种。平板置室温下干燥3～5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于培养基表面，各纸片中心相距大于24mm，纸片距平板内缘大于15mm［3］。共测试22种药物：庆大霉素、复方新诺明、头孢拉定、卡那霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、链霉素、新霉素、环丙沙星、强力霉素、四环素、头孢曲松、克林霉素、氨苄青霉素、阿米卡星、万古霉素、阿奇霉素、林可霉素、阿莫西林、多黏菌素B、痢特灵、壮观霉素。

1．6 PCR扩增

1．6．1 16SrRNA 引物PCR扩增及鉴定 以从肝、肺组织中分离培养得到的单菌落（用30μL灭菌超纯水冲散，取其中5μL）为模版进行PCR扩增，98℃预变性10min，（95℃30s；55℃30s；72℃1min 30s）30cycles，72℃10min，16℃1min。PCR体系：dNTP（2．5mmol／L）5μL，上下游引物（见表1）P1和P2各2μL（10μmol／L），10×TransTaq－T Buffer 5μL，TransTaq－T DNA Polymerase 1μL，模版5μL，加超纯水至总体系为50μL。将PCR产物进行琼脂糖凝胶（1%）电泳，回收PCR产物（使用上海捷瑞生物工程有限公司的DNA回收试剂盒，按其说明书操作），片段大小为1 300bp左右，回收产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1．6．2 荚膜分型PCR鉴定 PCR模版来源同上，PCR体系：dNTP（2．5mmol／L）5μL，上下游引物（见表 1）各 1μL（10μmol／L），10×TransTaq－T Buffer 2．5μL，TransTaq－T DNA Polymerase 0．5 μL，模版5μL，加超纯水至总体系为25μL。将PCR产物经琼脂糖凝胶（1%）电泳检测。所有PCR都设有阴性对照。

1．7 致病性试验 将所购买的10周龄健康鸡只随机分为7组，每组4只。购买后饲养1周，进行分离菌致病性试验。各组鸡均隔离饲养，饲料、饮水中不含任何抗生素。将从病料中分离纯化的多杀性巴氏杆菌培养在TSB（含10%血清）中，培养至OD600＝0．4。取出原菌液，用灭菌PBS稀释至浓度为102～107CFU／100μL，分别取出100μL细菌悬液注射其中6组鸡只的胸部肌肉内。最后一组注射100μL灭菌PBS。所有浓度的细菌悬浮液均做了细菌回复计数，攻毒后，鸡只正常饲养，观察并记录。

2 结果

2．1 病鸡剖检 4只临床病死鸡剖检结果非常一致。均可见腹膜有小出血点，肝脏表面有针尖大小呈灰白色坏死点和出血点，脾脏肿大，十二指肠高度充血和出血，肠黏膜表面有粉红色的黏液。心包有少量积液，心外膜及心冠脂肪有出血点，肺部充血、出血（见中插彩版图1）。

2．2 细菌形态观察 病死鸡的肺脏、肝脏、心血触片经革兰染色，镜检可见革兰染色阴性的小杆菌，经瑞氏染色镜检可见大量两极浓染的短杆菌。镜检表现典型巴氏杆菌特征（见中插彩版图2）。

2．3 病原分离培养及培养特性 无菌采取病死鸡的肺脏、肝脏、心血，划线培养于TSA（含10%血清）和麦康凯琼脂平板培养基，所有病料划线培养于TSA培养基上均可见光滑、湿润的水滴样小菌落。在麦康凯琼脂平板培养基上未见到菌落生长。取分离细菌革兰染色，镜检可见革兰染色阴性的小杆菌，经瑞氏染色镜检可见大量两极浓染的短杆菌。

2．4 16SrRNA序列分析 扩增的16SrRNA片段大小约为1 300bp左右，经上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，并使用在线工具BlastN（http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．cgi）搜索NCBI数据库，进行序列同源比对分析，发现该核苷酸序列与Pasteurellamultocidasubsp．multocida strain E348／08等多杀性巴氏杆菌的序列同源性最高，达98%。

2．5 荚膜分型鉴定 根据 Townsend等［5－6］描述的方法，使用PCR方法对分离的巴氏杆菌进行分型，只有A型Pm的引物PmA1，PmA2可扩增出1 000 bp左右的条带，符合预期的1 048bp片段大小，而其他组及阴性对照组均未扩出任何条带，表明该病原菌为荚膜血清A型，见图3。

2．6 分离菌株的致病性试验 攻毒12h后，CFU为107、106组的所有鸡只均急性发病死亡，除PBS组和CFU为102的组外，其他组出现不同程度的精神沉郁，嗜睡，缩颈畏寒，羽毛松乱，食欲减少，口鼻有浆液性，黏液性分泌物流出，并伴湿咳症状；1d后，CFU为105的组鸡全部死亡，CFU为104的组死亡3只，另1只极度衰竭，呼吸困难；2d后，CFU为103的组出现两只鸡死亡，CFU为102的组临床症状加重，PBS组正常；3d后，攻毒组鸡只全部死亡，PBS组正常。试验结果表明，该病原菌毒力很强，即便攻毒剂量只有100CFU都能导致鸡只感染后急性发病死亡。

2．7 药敏试验 22种药物测试结果显示，该病原菌对庆大霉素、复方新诺明、头孢拉定、卡那霉素、链霉素、新霉素、强力霉素、头孢曲松、克林霉素、氨苄青霉素、阿米卡星、万古霉素、阿奇霉素、林可霉素、阿莫西林、多黏菌素B、壮观霉素均表现出不同程度的耐药性。对环丙沙星、恩诺沙星、四环素、痢特灵、氧氟沙星5种抗生素敏感。

3 小结与讨论

禽巴氏杆菌病是由禽多杀性巴氏杆菌所引起的家禽和野禽的一种广泛分布的接触性传染病。该病对养禽业危害严重，禽类感染后常呈急性败血性过程，发病率和死亡率高，在各地呈散发性或地方性流行。对于中小养鸡场而言发病尤其严重，因此对禽巴氏杆菌病的诊断和防治是至关重要的。

2011年10月，广西某鸡场所在地区连日多雨，空气潮湿，多个养鸡场发生鸡急性致死病例，鸡群高度易感，病鸡主要表现为精神沉郁，缩颈闭眼，羽毛松乱，不愿走动，离群呆立，呼吸困难，口鼻分泌物增加，并伴有湿咳症状，最后发生极度衰竭，昏迷麻痹而死亡。发病急，死亡快，病程1～3d。根据流行病学和病鸡的临床表现，疑似为禽巴氏杆菌病。

为了进一步确诊，我们选取几只典型发病死亡的鸡进行病理剖检，发现内脏器官的病理变化与禽巴氏杆菌病的特征性病理变化表现相符，进一步的病原分离鉴定及染色镜检，发现该病原在TSA培养基上培养可见光滑、湿润的水滴样的小菌落，革兰染色阴性、瑞氏染色两极浓染，为球杆状的小杆菌，该病原表现出典型巴氏杆菌的特征［7］。参照Marchesi J R等人使用1 6SrRNA的1对引物进行PCR扩增鉴定，PCR产物经过测序并进行同源比对分析发现，该核苷酸序列与多杀性巴氏杆菌的序列同源性达98%，再1次确证分离到的病原为禽多杀性巴氏杆菌。在此基础上，我们对该病原进行了荚膜分型，使用 Townsend等［5－6］描述的方法，鉴定该病原为荚膜血清型A型。

至此，我们认为是A型禽多杀性巴氏杆菌引起了该鸡场疾病的发生。为了探知该病原的致病力强弱，我们选取了10周龄的健康鸡只进行了分离菌的致病性试验，发现该病原菌致病、致死能力非常强。这一结果与该鸡场的发病情况非常符合：鸡只发病急、死亡率高，给鸡场带来很大的损失。

鉴于此种情况，迅速给出防治方案非常重要。药敏试验结果显示，该病原耐药谱广，这与鸡场使用抗生素拌料、饮水治疗无效，病情得不到控制的情况相符，鉴于其对四环素、恩诺沙星药物敏感，我们推荐鸡场实行病鸡隔离，带鸡消毒的措施，并在饮水和饲料中添加四环素、恩诺沙星药物进行预防和治疗，通过两周的治疗，鸡场病情得到了有效控制。

［1］ 崔治中．兽医全攻略－鸡病［M］．北京：中国农业出版社，2011：206－210．

［2］ 陆承平．兽医微生物学 ［M］．北京：中国农业出版社，2010：19．

［3］ 孟丹，孟昱，张斌，等．耐药性禽巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性检验［J］．吉林畜牧兽医，2009，30（11）：33－34．

［4］ Marchesi J R，Sato T，Weightman A J，etal．Design and evaluation of useful bacterium－specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16SrRNA ［J］．Appl Environ Microbiol，1998，64（2）：795－799．

［5］ Townsend K M，O＇Boyle D，Phan T T，etal．Acute septicaemic pasteurellosis in Vietnamese pigs ［J］．Vet Microbiol，1998，63：205－215．

［6］ Townsend K M，Boyce J D，Chung J Y，etal．Genetic organization ofPasteurellamultocidacap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system ［J］．J Clin Microbiol，2001，39：924－929．

［7］ 李浩，刘阳，李长安．多杀性巴氏杆菌病研究进展［J］．畜牧兽医杂志，2011，30（2）：31－32．