20-羟基蜕皮甾酮对异色瓢虫幼虫的活力和保护酶活性的影响

庞海玉， 宇 佳， 迟德富， 李晓灿， 钱晶晶， 张超群

(东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨150040)

为了寻找更为理想的杀虫剂以便在害虫综合管理(IPM)中应用，自20 世纪世界各国均致力于无公害的“第三代杀虫剂”研究。结果表明，某些植物可以产生阻碍昆虫正常生长发育等生命活动的物质［1-5］，昆虫蜕皮激素类似物就是其中重要的一类。蜕皮激素又称为蜕皮甾酮，其主要作用是启动昆虫蜕皮［6-7］。随着研究的深入，人们发现外源20-羟基蜕皮甾酮(20-羟基蜕皮激素，20E)也能够影响昆虫的蜕皮，甚至使蜕皮提前。迟德富等［8］于2002 年发现，筋骨草中植物源蜕皮激素对杨干象2 龄幼虫具有杀虫作用。对于不同昆虫，外源蜕皮甾酮的有效浓度显著不同［9］。蜕皮激素类似物作为一种昆虫激素类化合物，在杀灭昆虫过程中很可能没有专一选择性，导致益虫死亡。针对这一问题，研究20E对分布范围广泛、种群数量大、控制力强的瓢虫的安全性及安全剂量就显得十分必要。

异色瓢虫［Harmonia axyridis (Pallas)］在俄罗斯、蒙古等国及中国各地均有分布，它对蚜虫、叶螨等重要害虫有很强的捕食能力，是重要的益虫［10-11］。本试验拟研究20E 对异色瓢虫幼虫的存活情况和捕食量及体内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性的影响，旨在确定田间施用植物源20E 对异色瓢虫的安全剂量。

1 材料与方法

1.1 试虫与饲养

供试异色瓢虫虫源由北京市农林科学院植保所提供，成虫饲养于塑料养虫盒(15.0 cm×10.0 cm×5.5 cm)中，每盒20 ～30 头，每12 h 或24 h 更换带有足量豌豆修尾蚜［Megoura japonica(Matsumura)］的豌豆苗1 次。成虫产卵后，将卵取出置于养虫笼中(不锈钢框架+120 目尼龙网，60 cm×40 cm×40 cm)，笼中放有接过蚜虫的蚕豆苗，异色瓢虫卵在笼内孵化，幼虫捕食笼内的蚜虫，完成幼虫阶段的发育，待羽化后转移到养虫盒中继续饲养第2 代，在实验室饲养3 代后选择同日龄异色瓢虫幼虫进行试验。

1.2 供试药剂

20E 采用陕西森弗生物技术有限公司的露水草提取物，为含98% 20E 的粉末，生产批号为RMLSCE111110-2。称取5 mg 20E，加250 μl 无水乙醇充分溶解，再加去离子水至5 ml 配制成母液。用去离子水稀释成工作液，稀释浓度分别为0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L。

考马斯亮蓝G-250、VB2、Met 均购自Amresco公司;SDS、PVP、PTU 购自Sigma 公司;愈创木酚和邻苯二酚购自天津市光复精细化工研究所;H2O2购自国药集团;其他药品均为分析纯。

1.3 毒力测定

采用喷雾法，选取同一天蜕皮的4 龄异色瓢虫幼虫以及带有足量蚜虫的蚕豆苗放入养虫笼中，用稀释后的20E 进行喷雾处理，每株蚕豆苗喷洒5 ml，以喷洒同剂量不添加20E 的5%乙醇作为对照。处理后每12 h，更换未经处理的携带有足量蚜虫的蚕豆苗饲喂幼虫。饲喂72 h，分别于处理后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 时检查死亡数。虫体变黑，用毛笔轻触无反应或不能活动的视为死亡。数据用SPSS 软件处理，计算致死中浓度(LC50)及其95%置信区间。分别于处理后4 h、8 h、12 h、24 h、48 h 取样。每浓度处理100 头4 龄瓢虫幼虫，重复3 次。试验在温度为(25 ±1)℃、相对湿度为(70 ±1)%、光照/黑暗为16/8条件的人工气候箱内进行。

1.4 20E 对异色瓢虫幼虫生长发育的影响

1.4.1 存活量 选取同一天蜕皮、长势一致的4 龄幼虫以及带有足量蚜虫的蚕豆苗放入养虫笼中，用稀释后的20E 进行喷雾处理，每株喷洒5 ml，处理后每12 h 更换未经处理的携带有足量蚜虫的蚕豆苗饲喂幼虫。分别在处理后第6 h、12 h、24 h、48 h和72 h 观察记录其死亡数。每浓度处理15 头幼虫，重复3 次。试验条件及对照组试验同1.3方法。

1.4.2 捕食量 在培养皿底垫一张滤纸，将带有1头蜕皮后6 h 的异色瓢虫4 龄幼虫和50 头成蚜的蚕豆苗放入培养皿内，用稀释后的20E 进行喷雾处理，每株喷洒5 ml，每处理重复6 次。处理后每隔12 h 清点剩余的成蚜数量。处理后每12 h 更换未喷施20E并携带有50 头成蚜的蚕豆苗饲喂瓢虫幼虫。共饲养72 h，然后统计每12h 内每头4 龄瓢虫幼虫取食的成蚜数量。试验条件及对照组试验同方法1.3。

1.5 植物源蜕皮激素类似物对异色瓢虫幼虫酶活性的影响

1.5.1 样品处理 采用喷雾法，选取同一天蜕皮、个体长势一致的4 龄幼虫以及带有足量蚜虫的蚕豆苗放入养虫笼中，用稀释后的20E 进行喷雾处理，每株喷洒5 ml，每处理12 h，更换未经处理的携带有足量蚜虫的蚕豆苗饲喂幼虫。饲喂48 h，于处理后4 h、8 h、12 h、24 h、48 h 取样，并于－80 ℃冰箱中保存。每浓度处理15头幼虫，重复3 次。试验条件同方法1.3。

1.5.2 POD 活性 酶液制备:从－80 ℃超低温冰箱中取出不同处理浓度及处理时间的4 龄试虫各3头，解冻，每头加1 ml 0.05 mol/L(pH 7.0)预冷的磷酸缓冲液(含1% PVP、0.04% 苯基硫脲和10 mmol/L EDTA)，冰浴上研磨至匀浆2 ～3 min，4 ℃、10 000 r/min离心15 min 后取上清为待测酶液。

活性测定:酶活性测定参考Simon 等［12］方法并略作修改。在试管中分别加入0.1 mol/L(pH 6.1)磷酸缓冲液1.8 ml、0.1%愈创木酚1.0 ml、待测酶液0.3 ml 和0.08% H2O21.0 ml，混匀后，室温反应20 min，以蒸馏水为对照，于470 nm 处测定OD 值。每个处理重复测定3 次。

1.5.3 SOD 活性 酶液制备方法同方法1.5.2。

活力测定:酶活测定参考Beauchamp 等［13］方法并略作修改。取3 ml 反应液［含50 mmol/L (pH 6.7)的磷酸缓冲液、13 mmol/L甲硫氨酸、10 mmol/L EDTA 和75 μmol/L硝基氮蓝四唑］，加0.07 ml 原酶液，再加0.6 ml 0.4 μmol/L的核黄素，4 000 lx 下光照15 min 后，立即避光迅速测定OD560值，以未光照的相同反应管为对照管，重复测定3 次，计算SOD酶活性，以达到50%抑制率所需的酶量为1 个酶活性单位(U)。

1.6 数据统计分析

所有数据均采用SPSS 软件和Microsoft excel 进行分析处理。

2 结果

2.1 20E 对异色瓢虫幼虫毒力的测定

20E 对异色瓢虫4 龄幼虫的致死中浓度(LC50)及其95%置信区间见表1。可以看出:20E 对异色瓢虫4 龄幼虫表现出较高的毒性，4 龄幼虫对20E敏感，随着处理时间的延长，LC50逐渐降低。参照6 h 的LC50作为试验设计的第二大浓度，48 h LC50作为试验设计的中间浓度，72 h 的LC50作为试验设计的第二小浓度，设计了0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L等5 个20E 浓度处理异色瓢虫4 龄幼虫，来测定20E 对其生长发育和体内酶活性的影响。

表1 20E 对异色瓢虫4 龄幼虫的毒性Table 1 Toxicity of 20E to the 4th instar larvae of Harmonia axyridis Pallas

2.2 20E 对异色瓢虫幼虫生长发育的影响

2.2.1 幼虫存活量 由图1 可以看出，0.1 mg/L 20E 喷洒蚕豆苗后，处理组与对照组的异色瓢虫4龄幼虫存活量在所有时间内均没有显著差异。0.5 mg/L处理后6 h，幼虫平均存活量与对照组差异不显著(P ＞0.05)，但从处理后12 h 开始，幼虫死亡数增加，到第72 h 时幼虫存活量与对照组呈极显著差异(P ＜0.01)。用1.0 ～10.0 mg/L的20E 处理后超过6 h 幼虫存活量均极显著低于对照组。特别是用5.0 mg/L和10.0 mg/L的20E 处理后72 h，幼虫全部死亡。说明20E 浓度超过0.5 mg/L时对异色瓢虫4 龄幼虫具有显著的杀伤作用，且浓度越高杀伤作用越大。

2.2.2 幼虫捕食量 如图2 所示，0. 1 mg/L 20E 喷洒蚕豆苗后24 h 以内，处理组异色瓢虫4龄幼虫的捕食量显著低于对照组(P ＜0. 05)，之后没有显著差异。说明该浓度处理对异色瓢虫4龄幼虫的捕食量影响时间短，且很快恢复到对照水平。

0.5 mg/L 20E 处理后36 h 以内捕食量显著低于对照组，之后捕食量明显回升，48 ～60 h 捕食量恢复到对照组水平，到第72 h，捕食量又有所下降。说明该浓度处理对异色瓢虫4 龄幼虫的捕食量产生了一定程度的影响。

当20E 处理浓度为1.0 mg/L时，幼虫捕食量在试验时间段始终是显著(P ＜0.05)或极显著(P ＜0.01)低于对照组。说明该浓度处理对异色瓢虫4龄幼虫的捕食量产生了显著影响。

20E 处理浓度为5.0 mg/L和10.0 mg/L时，绝大多数时间段内，捕食量都极显著低于同期对照组(P ＜0.01)，而且60 h 后瓢虫幼虫出现了死亡情况。说明这两种高浓度处理对异色瓢虫的4 龄幼虫捕食量产生了极大影响。

另外，从图2 可明显看出，在处理后同一时间内，随着20E 浓度的增加，异色瓢虫捕食量呈显著降低趋势。

图1 20E 处理后异色瓢虫4 龄幼虫存活量的变化Fig.1 The survival of 4th instar larvae of Harmonia axyridis Pallas treated by 20E

图2 20E 处理后异色瓢虫4 龄幼虫捕食量的变化Fig.2 The predation of 4th instar larvae of Harmonia axyridis Pallas treated by 20E

2.3 20E 对异色瓢虫幼虫酶活性的影响

2.3.1 超氧化物歧化酶( SOD) 活性 由图3 可以看出，不同浓度20E 处理异色瓢虫后短时间内，SOD的活性均受到抑制。但是0.1 mg/L 和0.5 mg/L 20E 的抑制时间较短，酶活力在24 ～48 h 内完全恢复到正常水平，说明这两种浓度对异色瓢虫4 龄幼虫比较安全。

1.0 mg/L 20E 喷洒蚕豆苗后8 h 时SOD 活力达到最低，极显著低于对照组(P ＜0.01);此后SOD 活力有所上升，至48 h 时可恢复部分活性，但仍极显著低于对照组(P ＜0.01)。这说明1.0 mg/L 20E 处理对异色瓢虫4 龄幼虫体内SOD 的活性有比较大的影响。

当20E 施用浓度达到5.0 mg/L或10.0 mg/L时，异色瓢虫4 龄幼虫体内的SOD 活性始终受到抑制，产生严重影响。

2.3.2 过氧化物酶( POD) 活性 由图4 可以看出，当20E 处理浓度为0.1 mg/L和0.5 mg/L 时，异色瓢虫4 龄幼虫POD 活性先受到抑制再逐渐恢复正常。处理后4 h，POD 活性即受到强烈抑制，与对照差异极显著(P ＜0.01)，仅为对照组的1/4 左右。这说明异色瓢虫幼虫体内POD 的活力水平对20E敏感，较低浓度的20E 在短时间内就能显著抑制POD 活力。但是随着时间的延长，POD 逐渐恢复，24 ～48 h 后基本恢复至对照水平。说明0.1 mg/L和0.5 mg/L 20E 对异色瓢虫幼虫的影响时间不长。

1.0 mg/L 20E 处理后12 h 以内，异色瓢虫4 龄幼虫POD 活力一直显著(P ＜0.05)或极显著低于对照(P ＜0.01)。此后，酶活力有一定程度的升高，但仅为低水平回复，低于同期对照组水平。说明1.0 mg/L 20E 对异色瓢虫4 龄幼虫存在很大安全隐患。

当20E 处理浓度为5.0 mg/L和10.0 mg/L时，异色瓢虫4 龄幼虫POD 活力始终保持在很低的水平，酶活力被极显著抑制(P ＜0.01)，认为这两种浓度对异色瓢虫4 龄幼虫不安全。

图3 20E 处理后异色瓢虫4 龄幼虫SOD 活性的变化Fig.3 Activity of SOD in the 4th instar larvae of Harmonia axyridis Pallas treated by 20E

图4 20E 处理后异色瓢虫4 龄幼虫POD 活性的变化Fig.4 Activity of POD in the 4th instar larvae of Harmonia axyridis Pallas treated by 20E

3 讨论

蜕皮激素是由前胸腺分泌的能调节节肢动物昆虫纲、甲壳纲等动物蜕皮的激素。其作用不仅触发蜕皮过程的开始，而且能确保整个蜕皮过程的持续进行，并促进新的表皮鞣化。司树鼎等［14］使用蜕皮甾酮类似物——虫酰肼及其衍生物0593 以0.05 mg/L 处理2、3 和4 龄家蚕和以0.01 mg/L处理2 龄家蚕均发生提前入眠、提前蜕皮现象，平均历期均比对照缩短0.5 ～1.0 d，本研究结果与之一致。另有大量研究证明，生物体在逆境条件下，细胞内自由基产生与清除平衡受到破坏，这些自由基有很强的氧化能力，对许多生物功能分子具有破坏作用［15］。SOD 和POD 是生物体内普遍存在的防御氧化损伤的重要酶类，能够防止自由基的毒害［16-17］。多数研究发现在逆境状态下SOD 和POD 等酶活性协调一致，呈现先抑制后激活再抑制的现象。本试验中，异色瓢虫幼虫在受到低剂量外源20-羟基蜕皮甾酮处理的逆境下，虫体试图将2 种保护酶的综合活力水平保持在与正常情况下相近的一种活力状态，以维持虫体内自由基的产生和清除之间的基本平衡，减轻自由基对虫体的毒害，这与鄢杰明等［18］和廖月枝等［19］关于研究蜕皮激素类对昆虫体内酶的影响结论类似。

综合幼虫存活率、捕食量和酶活性等指标变化认为，20E 浓度为0.1 mg/L对异色瓢虫4 龄幼虫安全;浓度为0.5 mg/L时比较安全，但存在一定的安全隐患;浓度为1.0 mg/L或更高时对幼虫不安全。

致谢: 北京市农林科学院植物保护环境研究所张帆和王斌老师对试验提供了帮助，在此特致谢意!

［1］ 苗建才.无公害杀虫剂及应用技术［M］. 哈尔滨:黑龙江科学技术出版社，1990.

［2］ 赵善欢，仇序佳.昆虫保幼激素类似物及其他生长调解剂对农林害虫防治试验研究的进展［M］//赵善欢. 杀虫剂与昆虫毒理进展.2 版.北京:科学出版社，1983.

［3］ 黄自然. 昆虫蜕皮激素的新进展［J］. 昆虫激素，1978 (1):67-72.

［4］ 王宏虬，缪福俊，李 彪，等. 核桃青皮提取物对马铃薯蚜虫与瓢虫的杀虫活性［J］.江苏农业科学，2012，40(7):112-114.

［5］ 乔淑芬，孙 杰，顾地周. 北乌头不同部位乙醇提取液对玉米蚜的生物活性［J］.江苏农业科学，2011，39(6):217-218，250.

［6］ 聂瑞麟，邱明华. 露水草工业生产蜕皮激素弃渣内的蜕皮甾酮［J］. 云南植物研究，1987，9(1):119-128.

［7］ ROBBINS W E. Ecdysones and analages:effects on development and reproduction of insects ［J］. Sciences，1991，161:1158-1160.

［8］ CHI D F，SUN M X，XIA W F. Pesticidal character of phytoecdysteroids from Ajuga multiflora Bunge (Labiatae)on larvae of Cryptorrhynchus lapathi L. (Coleoptera:Curculionidae)［J］. Journal of Forestry Research，2002，13(3):177-182.

［9］ 刘敬泽，张惠恋，赵秀颖. 蜕皮激素对长角血蜱若虫发育的影响［J］. 河北师范大学学报，1999，23(3):402-404.

［10］ 王小艺，沈佐锐. 异色瓢虫的应用研究概况［J］. 昆虫知识，2002，39(4):255-261.

［11］ KOCH R L. The multicolored Asian lady beetle，Harmonia axyridis:A review of its biology，uses in biological control，and nontarget impacts［J］. Journal of Insect Science，2003，3:1-16.

［12］ SIMON L M，FATRAI Z，JONAS D E. Study of peroxide metabolism enzymes during the development of Phaseolus vulgris［J］. Biochemistry Physiology，1974，166:387-392.

［13］ BEAUCHAMP C，FRIDOVICH I. Superoxide dismutase:improved assays and an assay applicable to acrylamide gels［J］. Analytical Biochemistry，1971，44(1):276-287.

［14］ 司树鼎，王开运，张文成，等. 虫酰肼及其衍生物0593 对家蚕的毒性及作用机理［J］. 昆虫学报，2008，51(11):1157-1163.

［15］ 李 慧，严善春，曹传旺. 呋喃虫酰肼对舞毒蛾生长发育和保护酶活性的影响［J］. 北京林业大学学报，2012，34(2):96-102.

［16］ 刘碧英，潘远智，赵杨迪，等. 藿香蓟(Ageratum conyzoides)对土壤铅胁迫的生理响应［J］. 应用与环境生物学报，2011，17(5):651-655.

［17］ LIU W T，ZHOU Q X，ZHANG Z N，et al. Antioxidant defense system and cadmium uptake in Chinese cabbage cultivars under Cadmium stress［J］. Proceedings of Conference on Environmental Pollution and Public Health，2010，9:447-451.

［18］ 鄢杰明，廖月枝，严善春. 甲氧虫酰肼对舞毒蛾解毒酶和保护酶活性的影响［J］. 东北林业大学学报，2010，38(11):112-114.

［19］ 廖月枝，严善春，李小平. 甲氧虫酰肼对舞毒蛾幼虫保护酶活性的影响［J］. 林业科学，2011，47(9):93-99.