小麦面筋蛋白酶解制备合适分子量小肽的研究

谷中华，朱 旭，杨凌霄，程李琳，王 立，张 晖，钱海峰

（江南大学食品学院与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡214122）

小麦面筋蛋白主要是由麦谷蛋白、麦醇蛋白、麦球蛋白以及麦清蛋白组成，其中麦谷蛋白和麦醇蛋白是面筋蛋白的主要成分（占85%左右），面筋蛋白富含谷氨酰胺和脯氨酸，由链内和链间的二硫键维持其结构，等电点偏中性。传统的营养学理论认为，机体对蛋白质的消化吸收和利用是以氨基酸的形式进行，但消化生理实验证明机体对蛋白质的利用更多的是以小肽的形式进行利用。小肽是由α-氨基酸以肽键的形式相互连接而成的链状化合物，是蛋白质水解的中间产物，按照小肽中氨基酸个数的不同，小肽可分为二肽、三肽、四肽等，分子量一般分布在1000u以内[1-2]。杨得胜等[3]利用胰蛋白酶和胃蛋白酶组合酶解面筋蛋白高效制备出谷氨酰胺小肽；孔祥珍等[4]利用碱性蛋白酶和中性蛋白酶对小麦面筋蛋白进行酶解，制备的小肽具有生物镇痛活性，且相对分子量在2000u以下；张亚飞等[5]利用碱性蛋白酶酶解面筋蛋白，所得的小麦肽混合物经树脂分离获得四种小肽成分，可以刺激小鼠脾细胞增值。

在传统利用蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的工艺中，往往只是利用水解度作为酶解控制的指标，而对于水解过程中蛋白酶的选择，酶解物中多肽含量及其分子量分布等指标考察的文献报道较少。根据已有的文献报道，碱性蛋白酶和中性蛋白酶在酶解面筋蛋白上的应用较多，而对胃蛋白酶和胰蛋白在其应用上的文献报道较少，而这四种蛋白酶都是目前工业化酶解蛋白中常见的商品化蛋白酶。因此本实验利用这四种蛋白酶对小麦面筋蛋白进行酶解，通过分析酶解物中蛋白质水解度与多肽含量之间的关系、多肽分子量分布、以及酶解物的氨基酸组成，探究不同的蛋白酶对小麦面筋蛋白酶解的影响，同时结合动物实验，探究酶解物的功能特性，为工业化酶解小麦面筋蛋白生产分子量分布合适的小肽产品提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦面筋蛋白（蛋白含量为75%） 常州联海生物科技有限公司；中性蛋白酶（Neutrase，9.62×105U/g）、碱性蛋白酶（4.3×105U/g） 北京诺维信有限公司；胃蛋白酶（pepsin，6.74×105U/g） SIGMA北京有限公司；胰蛋白酶（pancreas，4.0×105U/g） 国药集团化学试剂有限公司；ICR小鼠（雄性，体重（20±2）g） 上海斯莱克实验动物有限公司；IgG、IgM试剂盒 上海江莱生物科技有限公司；其他所用试剂 均为分析纯。

Waters600高效液相色谱仪 美国沃特斯公司；IKAMAG加热磁力搅拌器 广州仪科实验技术有限公司；HITACHI高速冷冻离心机日本日立公司；FORMA702超低温冰箱 THERMO公司；Free Zone2.5冷冻干燥机 美国Laboconcor公司；HZ-9212SB水浴恒温振荡器 江苏太仓实验仪器厂；H 835-50型氨基酸自动分析仪 Aglient公司。

1.2 实验方法

1.2.1 各种蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的最适条件通过对小麦面筋蛋白的酶解实验，并参考前期钱海峰等[6-7]对小麦面筋蛋白酶解物的制备及其功能性质的研究，得出各种蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的最适温度和最适pH，其中碱性蛋白酶的最适温度为50℃、最适pH为8.5，中性蛋白酶的最适温度为52℃、最适pH为6.5，胃蛋白酶的最适温度为37℃、最适pH为1.5，胰蛋白酶的最适温度为37℃、最适pH为8.5。在制备各自的酶解物时，碱性蛋白酶的加酶量为E/S= 1∶250，酶解时间3h，中性蛋白酶的加酶量为E/S= 1∶200，酶解时间4h，胃蛋白酶的加酶量为E/S=1∶250，酶解时间3h，胰蛋白酶的加酶量为E/S=1∶200，酶解时间3.5h。

1.2.2 小麦面筋蛋白的酶解方法 小麦面筋蛋白（WG）按1∶10（m/v）比例溶于水中，均质过后形成一定浓度的悬浮液，调节到合适的pH和温度后，加入一定量的酶，在恒温磁力搅拌器上进行酶解反应，待酶解反应结束后，在沸水浴中灭酶10min，分别制得胃蛋白酶的酶解物（PeWGH）、胰蛋白酶的酶解物（PaWGH）、中性蛋白酶的酶解物（NWGH）、碱性蛋白酶的酶解物（AWGH）。当上述酶解物溶液的温度冷却到室温条件下，用冷冻离心机离心（6000r/min，15m in，4℃），收集上清液，一部分用于测水解度和多肽含量，另一部分冷冻冻干后用于测定多肽的分子量分布和氨基酸含量。

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白质水解度的测定 蛋白质的水解度是指蛋白质中的肽键被断裂的程度。

本实验在中性和碱性条件下采用pH-Stat法、在酸性条件下采用三氯乙酸（TCA）法测定蛋白质水解度，见参考文献[8-9]。

1.3.2 多肽含量的测定方法 采用双缩脲法测定多肽的含量，对参考文献[10]作进一步改进。取酶解物上清液2m L，加入2m L的10%三氯乙酸溶液，均质后冷冻离心（6000r/m in，20m in，4℃），再取离心后的上清液2m L和3m L的双缩脲试剂混合均匀，在540nm波长条件下测量OD值，利用标准曲线（y=0.1075x-0.0189），得出样品上清液的多肽含量，计算公式见式（1）。

式中：A为OD值；N为样品稀释倍数。

1.3.3 多肽分子量分布的测定 采用高效凝胶过滤色谱法，见QB/T 2653-2004[11]。

色谱条件：色谱柱：TSKgel G2000SWXL；柱温：30℃；流动相：乙腈/水/三氟乙酸，10∶90∶0.1（体积比）；流速：0.5m L/m in；进样量：10μL；检测波长：UV220nm。

1.3.4 多肽样品中氨基酸含量的测定 测量方法：称样：根据样品中蛋白质的含量，称取适量的样品放入水解管中；水解：水解管中加入8m L的6mol/L的HCl，边抽真空边封管，封好后的水解管在110℃的烘箱中水解22h；定容：水解完毕后，将水解管中的溶液移出，用超纯水定容至25m L，然后用两层滤纸过滤，取滤液1m L移至25m L的烧杯，放入真空干燥器中抽真空30m in后，干燥过夜；蒸酸、取样：取出已蒸干的小烧杯，加入1m L的0.02mol/L的HCl，静置一段时间，然后用玻璃棒搅拌直接导入1.5m L的离心管内，10000r/m in离心10m in，取500μL至H 835-50氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成分析。

1.4 小麦面筋蛋白酶解物的功能性动物实验

取健康小鼠80只，适应性喂养一周后，随即分为六组，每组15只：正常对照组BG、面筋蛋白添加组WG、胃蛋白酶酶解物添加组PeWGH、胰蛋白酶酶解物添加组PaWGH、碱性蛋白酶酶解物添加组AWGH、中性蛋白酶酶解物添加组NWGH，后五组添加物的添加量都为5%，后四组添加的酶解物的蛋白质水解度为12%。

动物实验中各个实验指标的测量公式见式（2）、式（3）。

吞噬细胞吞噬率的测定方法见参考文献[12]。

IgG、IgM的测量方法严格按照说明书的要求进行测定。

2 结果与讨论

2.1 不同蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的酶解物中蛋白质水解度和多肽含量的关系

分别采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶对小麦面筋蛋白进行酶解，测量在不同的蛋白质水解度时酶解物中的多肽含量，结果见图1。

图1 四种蛋白酶酶解物的水解度与多肽含量的关系Fig.1 The relationship of four kinds of protease enzymatic hydrolysis between degree of hydrolysis and peptide content

从图1各种蛋白酶酶解物的曲线走势中可知，蛋白质水解度在15%范围内，四种蛋白酶酶解物中多肽含量随着蛋白质水解度的提高增加的速率较大，而蛋白质水解度超过15%以后，多肽含量的增加速率较为平缓，蛋白质水解度再进一步增加时，多肽含量呈现出下降的趋势。

因为蛋白质水解度较低时，酶的作用位点不饱和，蛋白酶酶解小麦面筋蛋白不充分，因此蛋白酶能快速地断裂面筋蛋白中的肽键，使其裂解为分子量较大的蛋白质和多肽，根据谷中华等[13-14]前期的实验结果也证实利用中性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白时，在最初的60min内，蛋白质水解度增加的速率最快，这也与在低水解度条件下多肽含量增加速率较快相吻合；随着蛋白质水解度的提高，酶的作用位点不断地与蛋白酶结合，当蛋白质水解度达到一定范围后，面筋蛋白上酶的结合位点可能已经趋于饱和，面筋蛋白被酶解的程度已经趋于最大，此时面筋蛋白的水解速率达到最大，多余的蛋白酶可能不会再与面筋蛋白结合，但会与小分子量的蛋白质、多肽进一步反应，从而使得多肽含量进一步增加；当蛋白质的水解度再增加，此时酶解物中可能含有对蛋白酶具有抑制作用的成分，蛋白质水解度的增加速率变得缓慢，并且伴随着蛋白酶与多肽不断的结合，会使得多肽被裂解为小肽和氨基酸，会使得多肽含量逐渐降低。

从图1中还可以看出，在水解度基本保持一致时，胃蛋白酶酶解物中的多肽含量明显高于其他三组，其次是碱性蛋白酶处理组，胰蛋白酶和中性蛋白酶处理组中多肽含量最低。

在酶解过程中，胃蛋白酶、碱性蛋白酶处理组需要添加大量的酸碱调节剂使得酶解溶液的酸碱度适应蛋白酶的最适酶解条件，因此在这两种蛋白酶处理组中，面筋蛋白本身会有一部分溶解在反应溶液中，蛋白酶与底物的作用面积很大，使得酶解效果更明显；胰蛋白酶处理组只添加少量的碱性调节剂，而中性蛋白酶处理组不需要添加酸碱调节剂，因此在酶活力和加酶量基本一致的情况下，胰蛋白酶处理组中的多肽含量比中性蛋白酶处理组要高，但比前两蛋白酶处理组要低。

2.2 不同蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的酶解物中多肽分子量分布

不同的蛋白酶即使对相同的底物，酶解效果也会有很大的差异。为了探究这四种蛋白酶对小麦面筋蛋白进行酶解时酶解物中多肽分子量分布之间的差异，在蛋白质水解度为12%时，分别测量四种酶解物中多肽的分子量分布，结果见表1。

结果表明，与没有酶解的小麦面筋蛋白相比，四种蛋白酶的酶解物中多肽的分子量分布总体偏小，说明酶解效果明显；而四种蛋白酶的酶解物在蛋白质水解度为12%左右时，碱性蛋白酶酶解物中小分子量肽（＜1000u）占80%左右，其次是胰蛋白酶的酶解物，占65%左右，而胃蛋白酶酶解物和中性蛋白酶酶解物中小分子量肽占30%左右。

表1 四种蛋白酶酶解物中多肽的分子量分布Table1 The four kinds of protease hydrolysates polypeptide inmolecularweight distribution

四种蛋白酶的酶解物中多肽分子量分布之所以有较大的差别，推测是由于本实验所用的碱性蛋白酶、中性蛋白酶属于内切酶，胃蛋白酶属于酸性蛋白酶，而胰蛋白酶的作用位点在赖氨酸和精氨酸之间，蛋白酶作用位点的不同，会使得蛋白酶在酶解小麦面筋蛋白的过程中，肽键断裂的程度和方式存在差异，从而对多肽的肽链结构产生影响，进而使得多肽的分子量分布有所不同。

2.3 不同蛋白酶酶解物的功能特性研究

在蛋白质水解度为12%时，将四种蛋白酶的酶解物添加到实验动物小鼠的基础饲料中，探究其多肽分子量分布与酶解物的功能性关系，数据采用Spss软件进行分析，数值以Mean±SD表示，实验结果见表2。

实验结果表明，添加AWGH、PaWGH酶解物的实验组与NWGH、PeWGH相比小鼠的平均采食量明显偏高，且差异性极显著（p＜0.01），小鼠的粗蛋白消化率也偏大，但差异性不明显；在免疫性方面，添加AWGH和PaWGH酶解物的实验组与NWGH和PeWGH相比小鼠的IgG含量明显偏高，且差异性极显著（p＜0.01），吞噬细胞的吞噬率和IgM的含量也偏大，但是差异性不明显。上述四种酶的酶解物添加组与基础组BG相比，在消化率和免疫特性方面都具有显著性的差异。

有文献报道[15-16]，多肽酶解物苦味的大小与肽分子量大小显著相关，当分子量为1000～4000u时具有苦味，而小于1000u的小肽几乎没有苦味，因此添加AWGH和PaWGH实验组的小鼠平均采食量较高；机体对于小肽的吸收是区别于氨基酸的，是一种相对独立的转运吸收方式，且小肽吸收机制不易饱和，转运速度快，小肽的比例越高，吸收就越迅速，上面的实验数据也表明添加AWGH和PaWGH的实验组小鼠粗蛋白的消化率较高。Cornell HJ[17]研究，小肽对免疫系统具有多方面的调节作用，既可有效提高非特异性免疫功能，增强巨噬细胞的吞噬能力，也可以对特异性免疫功能产生调节作用，本实验结果说明，使用适量的小肽可以提高实验动物血清的免疫球蛋白含量，能够诱导某些免疫功能的活化，增强免疫效果，添加AWGH和PaWGH对实验动物的消化和免疫机能有明显促进作用。

所以酶解小麦面筋蛋白的四种蛋白酶中，碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解小麦面筋蛋白制备小分子量肽酶解物存在着天然的优势，但是在制备酶解物的过程中，碱性蛋白酶要加大量的酸碱调节剂，会为后续产品的脱盐带来很大的技术难题。

2.4 不同蛋白酶处理小麦面筋蛋白的酶解物中氨基酸含量差异

为了进一步探究四种蛋白酶对小麦面筋蛋白酶解作用的差异，以及酶解过程中小麦面筋蛋白是否被裂解为氨基酸，以及断裂的程度，对上述四种酶解物中总氨基酸含量和游离氨基酸含量分别进行测定，结果见表3。

实验结果显示，四种蛋白酶在酶解小麦面筋蛋白时，蛋白质水解度在12%时，上清液中谷氨酸、脯氨酸含量都较高，这是因为面筋蛋白中的麦谷蛋白富含谷氨酸，麦醇溶蛋白富含脯氨酸。

四种蛋白酶的酶解物与没有酶解的小麦面筋蛋白相比，总氨基酸含量都明显增加，但是游离氨基酸含量没有明显变化，说明蛋白质水解度在12%时，酶解面筋蛋白生成的游离氨基酸含量较少，蛋白酶对底物的酶解程度适中，没有过度水解。在总氨基酸含量上，四种蛋白酶的酶解物与没有酶解的小麦面筋蛋白相比，必需氨基酸含量基本保持不变，而非必需氨基酸的含量有明显的提高，且非必需氨基酸含量明显高于必需氨基酸含量；而在游离氨基酸含量方面，四种蛋白酶的酶解物与没有酶解的小麦面筋蛋白相比，必需氨基酸含量有所增加，且必需氨基酸含量和非必需氨基酸含量差异不大，说明通过蛋白酶的酶解作用主要增加的是非必需氨基酸的含量。

3 结论

3.1 四种蛋白酶在酶解小麦面筋蛋白制备小分子量肽酶解物时，在多肽含量、小肽的分子量分布、氨基酸含量上与没有酶解的对照组相比，均有大幅度的提高，说明蛋白酶酶解效果显著。在蛋白质水解度保持一致时，胃蛋白酶处理组中多肽含量最高，其次是碱性蛋白酶处理组，然后是胰蛋白酶和中性蛋白酶处理组。

3.2 在小肽得率上，碱性蛋白酶的酶解效果最明显，在蛋白质水解度为12%左右时，小肽的得率超过80%，其次是胰蛋白酶，小肽的得率达到65%左右，然后是中性蛋白酶和胃蛋白酶，小肽得率在30%左右。

3.3 动物实验结果表明，在蛋白质水解度为12%时，碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解物可以显著的增加实验动物的消化和免疫功能，与中性蛋白酶和胃蛋白酶处理组相比在平均采食量和IgG的含量上具有显著性的差异，在粗蛋白消化率和IgM含量以及吞噬细胞的吞噬率方面也有提高作用。

表2 不同蛋白酶的多肽酶解物对实验动物的影响Table2 Effectofwheatgluten hydrolysateswith four kinds of protease on functionality in

3.4 在蛋白质水解度为12%时，四种蛋白酶的酶解物中总氨基酸和游离氨基酸含量与没有酶解的原料相比均有提高，但游离氨基酸含量差异不大，说明四种蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的酶解程度适中，没有过度水解；四种蛋白酶的酶解物中非必需氨基酸含量与没有酶解的原料相比均有提高，但必需氨基酸含量差异不大，说明蛋白酶的酶解作用主要是增加非必需氨基酸的含量。

表3 四种蛋白酶酶解物中氨基酸含量的差异Table3 The amino acid contentof change in four kinds of protease

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