Livin在妊娠滋养细胞肿瘤中的表达及意义

刘 韡 马 瑞 王艳霞 安瑞芳

1.西安交通大学第二附属医院妇产科，陕西西安 710004；2.陕西省妇幼保健院，陕西西安 710004；3.西安交通大学第一附属医院妇产科，陕西西安 710061

妊娠滋养细胞疾病（GTD）主要包括完全性葡萄胎（complete hydatidiform mole，CHM）、部 分 性 葡 萄 胎（partial hydatidiform mole，PHM）、侵蚀性葡萄胎（invasive hydatidiform mole，IHM）和绒毛膜癌（choriocarcinoma，CC）等，另外还包括胎盘部位滋养细胞肿瘤（placental site trophoblastic tumor，PSTT）和上皮样滋养细胞肿瘤（epihtelialrtophoblastieutmor，ETT）等少见类型。除葡萄胎外，又统称为妊娠滋养细胞肿瘤（gestational trophoblastic neoplasia，GTN），侵蚀性葡萄胎全部来自葡萄胎，而其他滋养细胞肿瘤可以来自正常或异常妊娠[1]。

妊娠滋养细胞肿瘤是一类严重威胁女性生殖健康的疾病，目前，主要靠动态观察血β-HCG 的变化及临床症状、体征来诊断GTN 及预测起恶变及预后，但这些临床特点的出现，具滞后性，甚至延误治疗[2]。因此，寻找新的治疗药物和有效的预后标记物，以及攻克本疾病仍需要不断进一步的研究。随着分子生物学技术的发展，研究发现多种因素参与其发病过程，比如癌基因、抑癌基因，凋亡因子，抑制凋亡因子等。

凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis proteins，IAP）是一类内源性细胞抑制因子，在很多物种中起抑制凋亡的作用，其过度表达引起凋亡不足、增殖过度，与肿瘤的发生密切相关。寻找有效的IAP 抑制剂，在肿瘤的治疗中有着广泛的应用前景[3-4]。Livin（又称KIAP，ML-IAP）是最新发现的一个IAP 家族中的成员，因其在肿瘤组织中的特异性高表达，已经成为近期研究的热点[5-6]。目前研究表明多种凋亡相关基因参与妊娠滋养细胞疾病的发生、发展，但Livin 蛋白在妊娠滋养细胞疾病中的表达以及相关性的研究却鲜有所见。

1 资料与方法

1.1 一般资料

22 例妊娠滋养细胞肿瘤患者病例均来自1993 年1月～2006 年1 月西安交通大学医学院第一附属医院。患者均为女性，年龄最小21 岁，最大53 岁，平均32.6 岁。手术治疗的侵蚀性葡萄胎患者的标本14 例，手术治疗的绒癌患者的标本8 例。并随机选择正常妊娠（5 ～12 周）行人工流产终止妊娠者的绒毛组织(正常绒毛细胞组)10 例作为对照。全部病例均经组织病理学证实。

1.2 主要试剂

兔抗人Livin 多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。兔SABC 检测试剂盒（SP-9001）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

取上述病例蜡块切片，厚4μm，采用免疫组织化学链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物（SABC）法检测。阴性对照：以磷酸盐缓冲液（PBS）代替第1 抗体；阳性对照：用已知阳性染色切片作阳性对照。

1.4 结果判定

每张切片选择有代表性的区域，并避开切片周边区域，观察阳性反应采用双盲法，并由有经验的病理科医师观察每张切片后一起做出判断。以滋养细胞胞浆或胞核出现棕黄色颗粒为阳性，每张切片显微镜下随机观察10 个视野，高倍镜（×400）下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。染色强度评分标准：染色强度以不着色为0 分，浅黄色为1 分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞数＜5%为0 分，5%～25%为1 分，26% ～50%为2 分，＞50%为3 分。

染色强度×阳性细胞百分数为每例组织染色的综合记分。0 ～1 分为阴性（-），2 ～3 分为弱阳性（+），4 ～6 分为阳性（++），＞6 分为强阳性（+++）。

1.5 统计学方法

采用SPSS13.0 软件包进行统计学分析，用四格表Fisher’s 确切概率法和Spearman 等级相关分析对数据进行处理，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Livin在GTN组织中的表达

在正常绒毛组织、GTN 中，Livin 的表达主要定位于合体滋养细胞和细胞滋养细胞的细胞核中，部分定位于细胞浆中。 细胞核棕黄色或棕褐色为阳性细胞，呈均匀染色状。正常绒毛组织、GTN 中Livin 的表达情况见图2 ～4。

表1，图1 结果可见，Livin 在正常绒毛组织和GTN组织中均有所表达，在侵蚀性葡萄胎、绒癌组织中表达明显，阳性率分别为100%（20/20）、57.1%（8/14）和87.5%（7/8），正常组织与GTN 组织中Livin 的表达差异具有统计学意义（x2=20.391，P ＜0.05）;利用Fisher确切概率法在四组之间进行两两比较发现，Livin 在侵葡和绒癌组织中的表达显著高于正常绒毛组织，差异均具统计学意义（P ＜0.05）。

表1 Livin在正常绒毛和GTN组织中的表达

图1 Livin 在正常绒毛和GTD 组织中的表达情况

2.2 Livin在GTN中的表达与临床特征的关系

由表2 结果可见，Livin 在22 例GTN 组织中的表达率为68.2%，Livin 在GTN 中的表达与临床分期具有相关性（P ＜0.05），且Ⅱ期＞Ⅰ期＞Ⅲ期，Livin 与GTN 患者的年龄、前次妊娠是否为葡萄胎、治疗前HCG 值的高低、是否有转移及预后无明显相关性（P ＞0.05）。

表2 Livin 在GTN中的表达与临床特征的关系

近十年来，妊娠滋养细胞疾病的分子生物学研究取得很大的发展，众多学者已经发现多种肿瘤标志物，与GTN 的发病发展有关，包括：白介素、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子、增殖性标志物中的PCNA、Ki-67、金属蛋白酶及其抑制物以及癌基因、抑癌基因等[7]。

图1 Livin 在正常绒毛中的阳性表达（×400）

图2 Livin 在侵葡中的阳性表达（×400）

图3 Livin 在绒癌中的阳性表达（×400）

3 讨论

研究表明，细胞凋亡(即细胞程序性死亡)的程序失去控制在肿瘤形成过程中有十分重要的作用[8]。参与调节细胞凋亡的基因就有可能参与了肿瘤的发生、发展过程，主要与三个基因家族即Bcl-2 家族、caspase 家族和凋亡抑制蛋白（Inhibitoror of apoptosis，IAP）家族关系密切[9-10]。

IAP 是一类内源性细胞抑制因子，其过度表达抑制细胞凋亡与肿瘤发生关系密切。Livin 作为一种新发现的IAP 家族成员，其具有的特异性BIR 和RING 指结构域，可以通过多种途径发挥抑制细胞调亡作用，主要是通过抑制Caspase 蛋白的级联激活反应来抑制凋亡过程[11-12]。目前，国内外文献中Livin 在GTD 中表达情况的鲜有报道。有相关研究表明，凋亡相关因子与葡萄胎的恶变相关，可能与滋养细胞低凋亡活性有关[13]。我们的研究结果显示Livin 在GTD 组织中，表达于细胞滋养细胞和合体滋养细胞的细胞核中，少部分表达在细胞质中，这与其他文献中的报道一致，但是我们无法解释为什么Livin 主要表达在细胞核中，而不是细胞质中，有可能是因为Livin 有两种不同形式的存在方式Livin α 和Livin β，这两种分子有不同的生物学特性及组织分布类型，但是它们都在凋亡信号启动后有着抑制凋亡的作用，两者起着相互协调的作用[14-17]。而在我们的试验中，单纯用免疫组织化学法是无法区分出到底是两者中的哪个起着主要作用，这有待于在将来的研究中找出两者在细胞中的不同的定位。

本实验表明，Livin 蛋白在GTN 中的表达与患者的年龄、前次妊娠是否为葡萄胎、治疗前HCG 的水平、有无转移、及预后无明显相关性，但Livin 与GTN 组织临床分期有明显相关性，说明Livin 蛋白的表达可能与GTN 的临床分期有关，但Livin 在GTN 中的表达Ⅱ期＞Ⅰ期＞Ⅲ期，却不是明显的正相关或负相关。因此本实验提示Livin 参与了GTD 的发病，并且与肿瘤的临床分期有关，但与其他研究中不同的是Livin 蛋白的表达与肿瘤的多项临床特征的相关性不明显，这有可能是因为不同肿瘤的发生机制不同，组织结构也不同，所以研究的结果也不尽相同，但也有可能与本实验样本量较少有关，这可以在以后的研究中进一步探讨。但是Livin 蛋白在GTD 中的高表达，以及抗凋亡作用的增强，还是可以说明，Livin 蛋白有可能作为GTD 诊断、预后不良的一个参考指标之一。

综上所述，Livin 在妊娠滋养细胞肿瘤中的高表达，提示可能参与了妊娠滋养细胞肿瘤的发生、发展，为临床诊断及治疗寻找新的作用靶点。

[1]乐杰.妇产科学[M].第7 版.北京：人民卫生出版社，2008：32-35.

[2] 谢丽，金晓艳，安瑞芳.滋养细胞增生与病变恶性程度相关性研究进展[J].国外医学妇幼保健分册，2005，16（6）：417-419.

[3] 王秀文.凋亡抑制蛋白（IAP）：抗癌新靶点[J].中国药理学通报，2004，20（2）：129-133.

[4] 汪丽平.甲状腺乳头癌中Livin mRNA 与Bcl-2 的表达及相关性研究[D].南昌：南昌大学，2008.

[5] Gazzaniga P,Gradilone A,Giuliani L,et a1.Expression and prognostic significance of Livin,survivin and other apoptosis-related genes in the progression of superficial bladder cancer[J].Ann Oncol, 2003,14（1）：85.

[6] Crnkovic-Mertens I,Hoppe-Seyler F,Butz K.Induction of apoptosis in tum or cells by siRNA-mediated silencing of the Livin/ML-IAP/KIAP gene[J].Oncogene，2003，22（51）：8330.

[7] Gross M,Dexter TM.GrowthfaetorsindeveloPmeni,transformation,and turmorigenesis[J].Cell,1991，64（2）：271-280.

[8] Conway EM,Pollefeyt S,Steiner-Mosonyi M,et al.Deficiency of surviving in transgenic mice exacerbates Fas induced apoptosis via mitochondrial Pathways[J].Gastroenterology，2002，123： 619-631.

[9] Hay BA,Wassarman DA,Rubin GM.Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death[J].Cell，1995，83（7）：1253-1262.

[10] 郑锦霞.妊娠滋养细胞疾病相关研究进展[J].国外医学计划生育/生殖健康分册，2007，26（5）： 288-292.

[11] Vucic D,DeshayesK,AckerlyH,et al.SMAC negatively regulates the antiapoptotic activity ofmelanoma inhibitor of apoptosis (ML-IAP).Biol Chem，2002，77（14）：12275.

[12] Scaffidi C,Fulda S,Srinivasan A,et a1.Two CD95(APO-1/Fas)signaling pathways[J].EMBOJ,1998，17（6）：1675-1687.

[13] Yang J,Liu X,Bhalla K,et al.Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked[J].Science，1997， 275（5302）:1129-1132.

[14] Kasof GM,Gomes BC.Livin,a novel inhibitor of apoptosis protein family member[J].J Biol Chem，2001，276（5）：3238-3246.

[15] Vucic D,Stennicke HR,Pisabarro MT,et al.ML-IAP,a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas[J].Curr Biol，2000，10（21）：1359-1366.

[16] Lin JH,Deng G,Huang Q,et al.KIAP,a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，279（3）：820-831.

[17] Ashhab Y,Alian A,Polliack A,et al.Two splicing variants of anew inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern[J].FEBS Lett，2001，495（122）：56-60.