植物次生代谢产物调控反刍动物瘤胃发酵及甲烷产生的研究进展

董瑞阳，孙凯佳，高腾云

(河南农业大学 牧医工程学院， 河南 郑州 450002)

气候变化自20世纪90年代以来便是国际政治最重要的议题之一，人类活动排放的大量温室气体改变了气候模式，导致全球变暖[1]。甲烷作为继二氧化碳之后第二大温室气体，对环境的危害不容忽视。目前甲烷气体正以每年0.9%的速度递增。农业生产中反刍动物平均每年的甲烷排放量为7.7×107t，占大气中甲烷排放量的15%，其中反刍动物瘤胃内产生的甲烷约占总排放量的90%(IPCC，1995)。化学添加剂及抗生素具有显著的调控反刍动物瘤胃发酵的效果，能显著改善动物的生产性能，减少甲烷气体的排放。然而由于在动物体内严重的化学残留及耐药性问题，化学添加剂已经对食品安全和人类健康构成了威胁，其应用推广也受到了限制。因此天然植物添加剂的开发应用逐渐成为反刍动物营养和环境工作研究的焦点。

中国作为中草药生产大国，拥有丰富的药用植物资源，其应用已经有几千年的历史。植物在生长发育过程中产生大量的生物活性物质，如挥发精油、皂苷、单宁、生物碱等成分，具有抗菌、促生长、提高免疫力和抗氧化等功能，这些成分被称为“植物素”或“植物次生代谢产物”。 1891年，Kossel明确提出了植物次生代谢(secondary metabolism)的概念。与初生代谢产物(糖、蛋白质、脂类和核酸)相比，植物次生代谢产物(plant secondary metabolites，PSM)是指植物体内一大类非生长发育所需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织和生长发育期的特异性[2]。研究表明，添加PSM能够调控反刍动物瘤胃内微生物菌群的活性，减少甲烷气体的排放。本文综合了国内外学者应用PSM(皂苷、单宁、及植物精油等)对反刍动物进行体外及体内试验的研究成果，对PSM影响反刍动物瘤胃的发酵模式及甲烷的产生进行了综述。

1 PSM的分类

植物次生代谢产物种类繁多、结构迥异，其合成代谢途径、属性及作用机制尚不明确[3]。根据结构的不同，一般可分为酚类化合物、烯萜类化合物及含氮有机物三大类。

1.1 酚类化合物

酚类化合物是指芳香烃苯环上的氢原子被羟基取代所生成的化合物，种类繁多，是重要的次级产物之一。根据其分子所含羟基数目可分为一元酚、二元酚和多元酚。广义的酚类化合物分为黄酮类、简单酚类和醌类。类黄酮是多酚化合物中的一大类，也是植物界酚类化合物中含量最多的成分，根据其分子结构及杂环吡喃环的构象可将其分为6类：黄酮、黄烷酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花青素苷。单宁是植物酚类多聚体中具有防御功能的一类物质，分为缩合单宁和水解单宁。缩合单宁是由类黄酮单位聚合而成的，可被强酸水解为花色素；水解单宁是不均匀的多聚体，含有酚酸(主要是没食子酸)和单糖，易被烯酸水解。大多数植物酚类的生物合成是从苯丙氨酸开始的，经过苯丙氨酸解氨酶(PAL)的作用，形成各种简单的苯丙酸类化合物、香豆素、苯丙酸衍生物、木质素、花色素苷、异黄酮、缩合单宁及其他类黄酮。黄酮类有不同的作用，起着管理初级代谢的作用，为花朵提供漂亮的颜色以帮助授粉，具有抗菌特性。

1.2 烯萜类化合物

烯萜类化合物根据形成结构与功能不同分为不同的种类，根据异戊二烯单位的个数分类，并由异戊烯基磷酸氢盐中合成而来。单萜类(C10)化合物结构迥异，含有多种功能性自由基的成分，如含碳化合物、醇类(香叶醇、柠檬烯、月桂烯、薄荷醇)、醛类(藏红花醛)、酮类(紫罗兰酮、樟脑)、酯类、醚类、过氧化物、酚类；倍半萜烯(C15)与单萜类具有相似的结构和功能，主要有青蒿素、莽草毒素、环桉醇；二萜(C20)是含有裸子植物树脂的酸的化合物(叶绿醇、生育酚、视黄醇)，银杏内酯、紫杉醇；二倍半萜类在植物领域分布广泛，多应用于药理学，如黄楝苦素A、菌类代谢产物蛇孢子假壳素A；三萜类(C30)是重要的萜烯类化合物之一，分为类固醇类、甾体皂苷类和强心苷类。皂苷属于三萜类化合物，由于其抗炎及抗菌性能被应用于药理学中，强心苷类也具有显著的药理学影响；四萜稀类(C40)含有类胡萝卜素和叶黄素，类胡萝卜素在光合作用中起着关键的生理作用，且由于其抗氧化活性被认为具有抗肿瘤的性能；多萜类(C>40)主要存在于天然橡胶中。此外，还有少数含硫的衍生物存在。单萜和倍半萜是构成植物中挥发油的主要成分，是香料和医药工业的重要原料。

1.3 含氮有机物

大多数含氮化合物是由普通的氨基酸合成的，主要有生物碱、胺类、非蛋白氨基酸、生氰苷和芥子油苷。生物碱是含氮有机物中最大的一类次生代谢物质，多数具较强毒性，对有机体具有致畸形作用。生物碱有不同的分类，有来源于鸟氨酸和赖氨酸的有机物，如阿托品、尼古丁、原烟碱、新烟碱和羽扇豆碱；来源于苯丙氨酸和酪氨酸的有机物，如蒂巴因、可待因、吗啡、罂粟碱；也有来源于色氨酸的有机物，如阿吗碱、长春新碱、长春花碱、奎宁和士的宁[3]。

2 PSM对反刍动物瘤胃发酵的影响

2.1 PSM对反刍动物瘤胃微生物的影响

瘤胃在反刍动物营养与生理功能中发挥重要作用。反刍动物日粮营养的供给绝大多数来自于瘤胃发酵终产物，尤其是挥发性脂肪酸和微生物蛋白。它们直接影响反刍动物的营养供给。挥发性脂肪酸为宿主提供主要代谢能量来源，而微生物蛋白是宿主机体代谢氨基酸和乳中合成氨基酸的主要来源。因此调控反刍动物瘤胃发酵对微生物生长与活性以及日粮营养成分的有效利用都具有重要的意义。

PSM被公认为具有抗菌、抗氧化的作用，其抗菌作用主要体现在侵入细菌的细胞膜，裂解膜的结构，从而改变离子渗透；对瘤胃微生物(原虫、真菌和细菌)的活性效果则主要取决于植物种类及其化学组成。氧化的单萜类，尤其是单萜醇类和醛类有较强的抑制瘤胃微生物生长和代谢的作用，而单萜烃类对瘤胃微生物的抑制作用较弱[4]。这些化合物的作用主要通过调控瘤胃pH、动物采食的日粮及PSM提取的工艺来实现[3]。

2.1.1 PSM对瘤胃原虫的影响 单宁、皂苷和一些植物精油都具有抗原虫活性的效果。以玉米、豆粕和羊草作为底物进行体外培养的条件下，添加不同浓度的茶皂苷、丝兰皂苷及二者的混合物均能够降低瘤胃液中原虫的数量，改变原虫各种属的比例，内毛虫比例下降而双毛虫和等毛虫比例上升，且随着培养时间的推移呈现逐渐下降的趋势[5]。体外和体内试验表明，添加丝兰提取物、皂树提取物、绞股蓝皂甙、无患子皂苷、苜蓿皂甙和感应草属皂苷均能够显著降低瘤胃原虫的数量，抑制原虫生长[6-12]，其中苜蓿皂甙能够提高具分解纤维能力的前毛属、双毛属及头毛属原虫占纤毛虫的百分比[10]。皂苷能够与原虫细胞膜的胆固醇结合，破坏细胞膜的完整性，使内外渗透压发生变化，改变了细胞膜的通透性，造成细胞溶解死亡，进而降低瘤胃液中的原虫数目[13]。尽管皂苷能抑制瘤胃纤毛虫的生长，但动物因个体差异对皂苷的敏感性不同，是否皂苷对所有原虫种类都作用明显仍不确定[3]。山羊饲喂添加有不同浓度胡枝子属单宁的日粮，体内纤毛虫的数量随着单宁浓度的升高而逐渐减少[14]，体外培养条件下，添加金合欢属单宁、银合欢属单宁、羽扇豆及含有芥子油苷的玛咖(maca)均能降低原虫总数[15-16]。体内条件下，奶牛采食添加越橘属单宁的日粮，体内原虫总数显著下降[17]。体外培养条件下，添加浓缩单宁和水解单宁的混合物可使纤毛虫的数目降低36.2%，而单独添加水解单宁只能使纤毛虫的数目降低12.3%[18]。单宁降低原虫数目的作用机制尚不明确。在水牛瘤胃液内添加不同比例薄荷油(0 μL/mL、0.33 μL/mL、1.0 μL/mL和2.0 μL/mL培养液)，结果发现：随着薄荷油添加量的增加，全毛虫和旋毛虫的数目极显著降低[19]。添加50 mg/L的辣椒油、丁香酚、八角茴香油、脱臭大蒜油及大蒜油培养24 h后，结果发现五种精油均能够显著抑制瘤胃原虫的生长[20]。由于植物精油的疏水特性以及与脂类的亲和力，它们能直接裂解细胞质膜，破坏膜蛋白导致细胞膜稳定性降低，使胞内成分渗出，甚至能使细胞质发生聚沉，最终细胞溶解[21]。但由于原虫是降解蛋白和纤维的主要微生物，PSM添加剂量过高时原虫数目骤减，容易造成营养物质不能够被动物机体吸收，因此在添加PSM调控瘤胃发酵时要明确适当的添加浓度范围。

2.1.2 PSM对反刍动物瘤胃真菌的影响 瘤胃真菌能够穿透植物细胞壁，通过降解纤维素和木质素为宿主提供能量。给山羊瘤胃内灌注不同浓度的绞股蓝皂甙，结果发现，在低浓度(2 g/d·h-1)条件下，真菌数量显著提高，而在高浓度条件下显著下降[6]。在绵羊日粮中添加不同水平的苜蓿皂苷，能够增加瘤胃内真菌总量[10]；添加2、4 mg/mL无患子皂苷培养24 h后，真菌数量没有变化，但培养48 h时真菌数量显著降低[11]。添加低剂量(0.33 μL)的薄荷油，真菌数量增加，当添加量为1.0和2.0 μL时，真菌数量下降[19]。添加八角茴香油真菌数量显著升高，而大蒜油和脱臭大蒜油能显著降低真菌数量[20]。

2.1.3 PSM对反刍动物瘤胃细菌的影响 不同种类的PSM对瘤胃细菌作用效果存在差异。体外培养条件下，瘤胃液中添加茶皂素、丝兰皂苷和苜蓿皂苷，瘤胃内三种纤维降解菌(产琥珀酸拟杆菌、黄化瘤胃球菌及白色瘤胃球菌)的数量均有增加的趋势[5,10]，山羊瘤胃内灌注不同浓度绞股蓝皂甙，产甲烷菌急剧下降，纤维降解菌在2 g/d·h-1添加水平下，数量显著提高，而高浓度条件下则线性下降[6]。添加低剂量无患子皂苷对黄化瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌没有影响，但高剂量时显著下降[13]。薄荷油添加量为0.33 μL时，黄化瘤胃球菌和产甲烷菌增加2倍，薄荷油添加量为1.0和2.0 μL时，总微生物、琥珀酸拟杆菌和产甲烷菌密度大幅下降[19]。添加银合欢单宁，产甲烷菌数量显著下降[16]。体内试验的条件下，植物精油的抗菌活性具有不确定性，可能是因为在体外培养条件下影响瘤胃发酵的精油浓度在体内试验中被证实浓度过高，对动物机体的瘤胃发酵产生毒性效应，且影响日粮的适口性[22]。由于PSM对原虫的抑制作用影响了原虫对细菌的吞食，从而导致瘤胃中细菌总量增加，纤维降解菌的数量也随之增加，有助于改善纤维饲料在瘤胃内的发酵和降解[5]。而产甲烷菌与原虫存在共生关系，产甲烷菌粘附在原虫表面或生活在原虫体内[23]，产甲烷菌的密度可能随着原虫的减少而逐渐降低。

2.2 PSM对反刍动物瘤胃发酵参数的影响

2.2.1 PSM对反刍动物瘤胃液pH的影响 瘤胃细菌繁殖最适pH范围6.0～7.0，微生物蛋白质合成最适pH范围为6.3～7.4。因此瘤胃液pH的变化直接影响瘤胃发酵。体外培养条件下添加丝兰皂苷、茶皂苷、无患子皂苷及绞股蓝皂甙，瘤胃液的pH随着添加量的增加而逐渐降低[5-8],而饲喂含11 mg/g皂苷、11 mg/g单宁和生物碱类的无柄感应草属植物提取物后，山羊瘤胃液内的pH随着皂甙添加量(0～26 mg/kg)的不断添加，呈现升高的趋势(6.91～7.02)[12]，也有研究表明添加丝兰皂苷提取物、苜蓿皂苷及银合欢单宁对瘤胃液pH影响不显著[9-10,16]。反刍动物瘤胃液内pH的变化与日粮结构紧密相关，精料较粗饲料含有较多的非结构性碳水化合物，若精料含量较高，瘤胃微生物快速发酵产酸，pH下降。

2.2.2 PSM对瘤胃内氨态氮的影响 瘤胃液中的氨态氮是瘤胃氮代谢过程中外源蛋白质和内源含氮物质降解的重要产物，它同时也是瘤胃微生物合成菌体蛋白的原料，因此其浓度是瘤胃内环境参数的一个重要指标。原虫在日粮蛋白的降解中起着重要的作用，因此具有驱原虫作用的皂苷能显著降低瘤胃内氨态氮的浓度[7,9-12]，以苜蓿草粉为底物对干奶牛的瘤胃液进行体外培养，发现添加浓度为(0、20、40、50、60、100、150 g/kg·DM)的白坚木单宁和单宁酸可降低瘤胃液内氨态氮的浓度， 且氨态氮浓度随着添加剂浓度的升高而逐渐降低[24]。但王新峰[6]研究表明，瘤胃液内氨态氮的浓度随着绞股蓝皂甙添加量的增加而升高，添加量为40 mg时达到显著水平。由于原虫占到瘤胃微生物生物量的50%，添加皂甙后原虫裂解释放大量的微生物蛋白，进一步被分解为氨氮，引起瘤胃氨态氮浓度水平上升。瘤胃内灌注绞股蓝皂甙，高剂量时瘤胃内氨态氮浓度显著降低。一些PSM降低瘤胃氨态氮的浓度，可能是由于其抗原虫活性，原虫在瘤胃内分泌脱氨酶不断降解饲料中的蛋白质生成氨态氮，而又不能利用氨态氮合成自身的蛋白质，因此原虫是氨的净生产者，抑制原虫数量可能直接导致瘤胃氨态氮浓度的降低[25]。

2.3.3 PSM对瘤胃内VFA的影响 VFA是瘤胃微生物发酵的终产物，是反刍动物代谢所需要的主要能量来源，约占反刍动物吸收能量的70%～80%。一些研究表明添加PSM能够改变瘤胃内产酸模式，增加总挥发性脂肪酸的产量，产生更多的可利用能量满足反刍动物的需要，同时丙酸产量增加，乙酸与丙酸比值降低[5,7-9]。 然而添加感应草属皂苷总挥发性脂肪酸含量线性降低(P<0.05)，乙酸和丙酸浓度升高，丁酸浓度降低[12]。五倍子酸单宁升高总挥发性脂肪酸的浓度，而白坚木单宁则降低TVFA的浓度[24]。当薄荷油添加量为1.0和2.0 μL时，总挥发性脂肪酸浓度极显著下降，而添加量为0.33 μL时，对总挥发性脂肪酸浓度没有影响[19]。添加300 mg/L的大蒜油显著降低TVFA的浓度，而低浓度的大蒜油对其浓度无影响[20]。不同来源的PSM及日粮结构对PSM的活性产生不同的影响，因此对瘤胃内产生的VFA浓度的影响也不同。

2.3.4 PSM 对瘤胃内微生物蛋白的影响 微生物蛋白(MCP)是瘤胃微生物经复杂的发酵过程而合成的。山羊饲喂添加茶皂素和丝兰皂苷混合物能够降低原虫真蛋白产量而提高细菌真蛋白产量[5]，以羊草、豆粕和玉米为发酵底物，添加不同剂量的绞股蓝皂甙进行传代培养，结果表明MCP的浓度除了第一代10 mg和20 mg组高于对照组外，不同代的处理组，MCP浓度都低于对照组[6]。 瘤胃原虫和细菌之间存在着拮抗作用，原虫数量的减少使得瘤胃内细菌数量增加，细菌的真蛋白产量提高，最终使微生物蛋白产量也有上升的趋势。

3 PSM对瘤胃甲烷产生的影响

PSM通过抑制产甲烷菌的增殖和减缓瘤胃微生物的代谢过程减少反刍动物瘤胃发酵产生的甲烷气体[3]，甲烷的产生量与瘤胃内挥发性脂肪酸有一定的关系，研究表明，丙酸产量与甲烷产量呈较高的负相关，乙酸产量和乙酸与丙酸比例同甲烷产生量呈较高的正相关[26]。体外培养条件下，添加茶皂素提取物，可减少甲烷和氢气的产生[8]。添加丝兰提取物培养4～6 h时，甲烷降到最低，且随着添加量的增加，甲烷排放量线性降低[9]。山羊瘤胃内灌注不同浓度的绞股蓝皂甙，甲烷产量有下降的趋势，氢的利用率提高[6]。皂苷降低瘤胃甲烷排放的原因可能是由于甲烷抑制了纤毛虫及与氢气产生有关的纤维降解菌的活性，并且增加了丙酸的含量。利用开放式呼吸量热系统测定饲喂添加不同水平胡枝子属浓缩单宁的波尔山羊的甲烷排放量，结果表明：随着添加量的不断减少，甲烷排放量升高[14]。当薄荷油添加量为0.33、1.0、2.0 μL时，甲烷产量分别下降了19.9%、46.0%和75.6%(P<0.001)[19]。体外培养条件下，添加高浓度(>300 mg/L培养液)从百里香、牛至、肉桂、大蒜、辣根、、大黄、、鼠李皮中提取的植物精油能够抑制甲烷的排放，但在实际的饲喂过程中，其持续作用效果如何仍不确定[22]。

4 小 结

综上所述，植物次生代谢产物对于调控反刍动物瘤胃发酵模式、抑制瘤胃甲烷的产生具有良好的作用效果。但目前的多数研究均是在体外培养的条件下进行的，即便经体外试验筛选后，在动物体内的实际应用效果仍存在不稳定性，如体外试验中的有效添加量在实际的饲喂过程中是否会对试验动物产生毒性、抑制日粮的降解、影响动物生产性能以及对日粮的适口性影响与否均不确定。植物次生代谢产物受不同的来源与种类、添加剂量、动物种类、日粮精粗比等多种因素的影响对反刍动物的作用效果不尽相同，因此植物次生代谢产物在反刍动物体内的作用机制、不同种类的最佳使用剂量等问题有待进行深入研究。

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