中草药混菌发酵生产新型生物中药的研究

■戴 燊 程茂基 韩 信 吴 超 李小燕

（安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036）

众所周知，抗生素的滥用在我国屡禁不止，但是抗生素的大量长期使用会造成有害菌种的耐药性及畜产品药物残留。食用药物残留的畜产品，会使人类产生过敏反应、中毒等危害，并损害身体健康[1]。随着人们生活水平的不断提高，对高品质畜产品的不断追求，开发安全、绿色、无毒的新型饲料来替代抗生素是当前我国养殖业必须坚持的道路，这也成为时下科研院校单位研究的热点问题。

自20世纪80年代开始，人们对于中草药饲料添加剂的研究热情不减。大量的试验表明中草药添加剂不仅能提高生产性能，而且有良好的抗菌作用；中草药还具毒副作用小、残留低、无抗药性等优点[2]。如山茶籽饼（粕）粉中含有丰富的糖萜素，杜仲叶中含有丰富的绿原酸；黄芪中含有丰富的黄芪多糖；松针粉中含有丰富的松针油；淫羊藿中含有丰富的皂甙；甘草中含有丰富的甘草多糖、甘草酸、甘草黄铜。研究表明，这些皂甙、生物碱、植物甾醇和有机酸等活性物质可以明显提高动物生产性能和免疫力[3-6]。但是中草药由于植物细胞壁的阻碍作用，使得药性难得到充分释放，然而，中草药经过微生物发酵后，由于植物细胞壁被酶解，大量的活性物质溶出，极大程度地提高了有效成分的含量，如吴志勇等[7]将黄芪发酵，结果可以大大提高黄芪的疗效。虽然中草药发酵技术取得了不少进展,但是目前国内外少数一些中草药产品或研究仍有不足之处:①产品或研究都是单一的有氧发酵或厌氧发酵，即要么只有氧发酵，要么只采用厌氧发酵，未见有氧和厌氧异步发酵的报道或产品；②饲用发酵与酶解提取中草药的组方也大多是单一的，缺乏科学的中草药复合组方发酵产品或研究。③发酵菌种的合理选择，菌种混合发酵相对单一菌种发酵而言，具有更强的生物转化能力，选择合适的发酵菌种，对生物发酵的生产具有重要意义。本研究先采用黑曲霉有氧发酵产纤维素酶、果胶酶等破解植物细胞壁，再用植物乳杆菌厌氧发酵酶解。采用的黑曲霉是经过N+注入经过选育的高产纤维素酶，、果胶酶、蛋白酶等酶的菌株，植物乳杆菌可产生大量的营养因子，维生素以一些促生长因子。发酵中草药由山茶籽饼（粕）粉、黄芪、山楂、甘草、淫羊藿组成的复方中草药。通过研究最佳混菌发酵工艺条件下产纤维素酶活、果胶酶的活力大小，以及通过发酵前后营养成分的比较，最终为开发出一种可替代抗生素的绿色、健康、环保的新型生物饲料提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

本实验室保存的黑曲益生菌株AN03（N+注入诱变选育的高产酸性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的菌株）、植物乳杆菌ANCLA01。

1.1.2 中草药组方

山茶籽饼（粕）粉、黄芪、山楂、松针粉、淫羊藿，购自合肥琥珀中药店。去杂粉碎过80目筛。

1.1.3 黑曲霉斜面培养基

PDA培养基；植物乳杆菌ANCLA01:MRS培养基。

1.1.4 液体种子培养基

PDA培养基（不加琼脂）；植物乳杆菌AN⁃CLA01:MRS培养基（不加琼脂）。

1.2 试验方法

1.2.1 基础培养基的优化

在单因素研究水平的基础上，采用4因素3水平正交设计试验，确定最佳培养基。有氧黑曲霉发酵阶段温度30℃、厌氧植物乳杆菌发酵阶段温度为37℃，有氧、厌氧发酵时间比为2∶1，总发酵时间为96 h，接种比例为2%∶2%，pH值为5。研究中草药浓度，葡萄糖添加量、酵母膏添加量、以及K2HPO4添加量对纤维素酶活、果胶酶活的影响（见表1）。

表1 最佳培养基正交试验因素与水平

1.2.2 发酵条件的优化

在以上单因素试验基础上，确定最佳培养基后,设计4因素3平水正交试验（见表2），研究有氧厌氧发酵时间比、总发酵时间、接种比例、pH值对混菌发酵的影响，以纤维素酶活、果胶酶活为衡量指标确定混菌发酵的最优条件。

表2 最佳发酵条件正交试验因素与水平

1.2.3 粗酶液的制取

纤维素酶液的制备：将发酵液用0.45 μm的滤膜过滤，吸取1 ml酶液于一定体积的容量瓶中，用缓冲溶液定容，测定酶活时取一定合适的倍数。

果胶酶液的制备：将发酵液用0.45 μm的滤膜过滤，吸取1 ml酶液于一定体积的容量瓶中，用缓冲溶液定容，测定酶活时取一定合适的倍数。

1.3 测定方法

纤维素酶活测定采用DNS法：在37℃，pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为4 mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位[8]。

果胶酶活测定采用DNS法：1 g酶液在50℃、pH值为5.0的条件下，1 h分解果胶产生1 mg半乳糖醛酸为一个酶活单位[9]。

粗蛋白测定采用凯氏定氮法；

粗灰分、钙磷等营养成分参照张丽英[10]《饲料分析及饲料质量检测技术》的方法检测；

中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、木质素测定采用Van Soest法测定。

1.4 数据处理

数据处理与分析使用SAS软件，进行方差分析与多重比较。

2 结果与分析

2.1 基础培养基的优化

表3 培养基优化正交试验结果及极差分析

由表3的正交试验结果分析可以看出，影响纤维素酶活、果胶酶活力的四个因素的主次顺序为：中草药浓度＞酵母膏添加量＞K2HPO4添加量＞葡萄糖添加量，其中中草药浓度对两种酶活的影响有显著差异（P＜0.05），其他添加量对酶活影响不显著(P＞0.05)。当中草药浓度过大时，中草药液中的物质对菌种的产酶有一定的抑制作用。表3可以看出，最佳发酵浓度为10%。从表3可以看出最优组合为A2B1C1D1，即中草药浓度为10%，葡萄糖添加量为1%，酵母膏添加量为0.2%，K2HPO4添加量为0.1%时，产纤维素酶活和果胶酶酶活力最高，由于表中并没有这个组合,因此对该最优水平进行分析验证，测得在此条件下纤维素酶活达到1 398.5 U/ml，果胶酶活达到1 259.3 U/ml。因此，确定基础培养基：中草药浓度为10%,葡萄糖添加量为1%,酵母膏添加量为0.2%，K2HPO4添加量为0.1%。

2.2 最佳发酵条件的优化（见表4）

表4 培养条件优化正交试验结果及方差分析

由表4的正交试验结果分析可以看出，影响纤维素酶活、果胶酶活的四个因素的主次顺序为好氧厌氧时间比例＞总发酵时间＞接种比例＞pH值，其中好氧厌氧时间比例、总发酵时间对两种酶活的影响差异极显著（P＜0.01）,接种比例差异显著（P＜0.05），pH值对产酶的影响不显著(P＞0.05)。好氧厌氧时间比例低，好氧时间短，影响黑曲霉的生长繁殖，因而分泌的酶量较低，好氧厌氧发酵时间比例相等时，黑曲霉的发酵时间也相对较短，因而产生的酶量也少。总发酵时间过长过短对两种酶活的影响都很大，发酵时间过短不利于菌种的生长繁殖，发酵时间过长，营养物质消耗过多，菌种生产环境恶化，对发酵也造成不利影响。在此表中，可以看出最优发酵条件组合是A3B2C2D1，即好氧厌氧发酵时间比为2∶1，总发酵时间为96 h，接种量比例为2%∶2%，pH值为5时，由于表中没有此组合，因此对该最优水平试验分析，测得此条件下纤维素酶活达到1 412.3 U/ml,果胶酶活达到1 287.5 U/ml。由此，确定发酵条件为：好氧厌氧发酵时间比为2∶1，总发酵时间为96 h，接种量比例为2%∶2%，pH值为5。

2.3 发酵前后营养成分的变化

由表5中试验结果可知，中草药经混菌发酵，粗蛋白由发酵前的11.35%提高到14.89%，提高了31.19%，粗脂肪提高了59.11%，Ca、P含量分别提高了50%、85.71%，中性洗涤纤维，酸性洗涤纤维，木质素分别降解了24.21%、12.58%、17.56%。营养价值有了明显的提高。

表5 发酵前后营养成分对比（%）

3 讨论

3.1 微生物的生长繁殖需要适宜的渗透压环境，菌体的正常繁殖速率，在通常情况下与底物的培养基的浓度成线性关系，但是，底物浓度过高，培养基的粘度必然增加，影响到培养基的渗透压和溶氧，对微生物生长反而不利。而且，培养基过于丰富，有时会使菌体生长过盛，发酵液非常粘稠，使得传质状况变差，不利于产物的合成[11]。因此.必须选择合适的底物浓度。本试验中发酵培养基的最适底物浓度为10%，这与韩春杨[12]的研究报道一致。

好氧厌氧发酵时间过低或者相等时，好氧黑曲霉没有足够的时间产生足够量的纤维素酶、果胶酶等，因而合适的好氧厌氧发酵时间比例对酶活的产量有极显著的影响。总发酵时间过短不利于菌种的正常生长繁殖；而时间过长，有机营养物质被大量消耗，影响培养基的渗透压和溶氧，对发酵反而不利，本试验选用总发酵时间为96 h，这与朱平军的研究报道一致[13]。

合适的接种比例对产酶量也有显著的影响，接种量比例不均不利于有益菌的正常繁殖，还可能产生竞争关系，反而影响产酶量，本试验两种菌的接种比例为2%∶2%。

pH值是影响菌种正常生长繁殖的因素之一，本实验的最适产量pH值为5，这可能因为一方面在此pH值时，有利于有益菌种的正常繁殖，另一方面抑制了其他杂菌的正常繁殖。

3.2 中草药经混菌发酵后，其营养价值有了明显的提高，尤其是极大的降解了纤维素含量，从而破解了大量的细胞壁，使得药物活性更大地释放出来，提高了中草药的综合利用价值，本试验采用的是经过N+注入诱变选育的高产酸性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的黑曲霉菌株以及植物乳杆菌ANCLA01。此两种菌种的好氧与厌氧混菌发酵对酶量的高产有功不可没的作用。

4 结论

4.1 本试验先采用黑曲霉有氧发酵，再用植物乳杆菌厌氧发酵，生产新型生物中药，最佳培养基条件为中草药浓度为10%，葡萄糖添加量为1%,酵母膏添加量为0.2%，K2HPO4添加量为0.1%，有氧发酵温度为30℃，厌氧发酵温度为37℃，好氧厌氧发酵时间比为2∶1，总发酵时间为96 h，接种量比例为2%∶2%，pH值为5。在比条件下纤维素酶活达到1 412.3 U/ml，果胶酶活达到1 287.5 U/ml。

4.2 中草药经混菌发酵后，粗蛋白由发酵前的11.35%提高到14.89%，提高了31.19%，粗脂肪提高了59.11%，Ca、P含量分别提高了50%、85.71%，中性洗涤纤维，酸性洗涤纤维，木质素分别降解了24.21%、24 12.58%、17.56%。营养价值有了明显的提高。