BHBA对体外培养犊牛肝细胞HMGCS基因表达的影响

■李 鹏刘敏跃龙 淼郭 洋 王 哲 何剑斌 刘国文

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866；2.辽宁省农牧业机械研究所有限公司，辽宁沈阳 110036；3.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春 130062)

围产期奶牛干物质摄入减少，能量需求增加，机体处于能量负平衡状态，从而使这一时期成为酮病等营养代谢性疾病的高发期。能量负平衡势必会促进机体脂肪动员，导致大量游离脂肪酸（NEFA）进入血液并最终进入肝脏代谢。当进入肝脏的NEFA超过肝脏本身氧化代谢速率时，大量NEFA就会发生不完全氧化而生成酮体或再酯化合成甘油三酯，从而引发酮病或脂肪肝[4]。酮体主要包括β-羟丁酸（BHBA）、丙酮、乙酰乙酸，其中BHBA大约占70%。

肝脏是BHBA合成的主要器官，3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A合成酶（HMGCS）是BHBA合成过程中的关键限速酶。BHBA作为机体主要的中间代谢产物，酮病时其在奶牛血液中的浓度发生显著改变。但有关高水平BHBA对脂肪酸在肝脏氧化代谢过程尤其是BHBA自身合成的影响则鲜有报道。本研究采取新生犊牛肝细胞原代培养方法，检测外源性BHBA对HMGCS基因表达水平的影响，进一步探讨BHBA对奶牛肝脏脂肪酸氧化代谢途径的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

琼脂糖、Tris、蛋白胨、酵母提取物、Taq DNA聚合酶、RNAisoTMPlus、DNA Marker DL 2000、pMD18-T Simple Vector，TaKaRa公司产品；小剂量快速质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒，杭州维特杰公司产品；SYBR GreenⅠ荧光定量PCR试剂盒，杭州博日公司产品；焦磷酸二乙酯（DEPC）、HEPES、BHBA，Sigma公司产品；Bovine 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase ELISA kit，CUSABIO公司产品；RPMI-1640，Gibco公司产品；氯仿、异丙醇、乙醇等均为国产分析纯。

1.2 犊牛原代肝细胞的分离与培养

采用张才等改良的胶原酶两步灌流法分离培养犊牛肝细胞。

1.3 肝细胞的分组与处理

培养72 h后，选择生长状态良好的肝细胞进行试验，分为空白对照组与BHBA试验组，BHBA组分别添加含有不同浓度的 BHBA（0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mM）的细胞培养液，每个处理孔设3个重复。继续培养24 h后分别提取各孔细胞的总RNA和总蛋白，-80℃保存备用。

1.4 HMGCS mRNA表达水平检测

表1 试验用PCR引物序列

采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对HMGCS基因进行定量。首先根据GenBank中登录的 HMGCS mRNA（NM_001045883）和β-actin（NM_173979）序列及引物设计原则，利用Primer Express 2.0软件设计引物，具体引物序列见表1。按常规方法进行目的基因的克隆、连接、转化和鉴定，获得阳性定量模板克隆质粒，将阳性质粒分别稀释至 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，根据8个浓度的值绘制标准曲线。采用双标准曲线的方法分析基因的相对表达差异，以最大限度减少试验误差，计算结果及数据统计采用F值表示，计算公式如下：

1.5 HMGCS蛋白表达水平检测

采用ELISA法，用预冷的PBS洗涤细胞2次，每孔加 200 μl细胞裂解液，作用 3～5 min，再转移至1.5 ml离心管中，每隔5～6 min轻柔振荡1次，共4次，4℃，1 000 r/min离心3 min，取上清，-80℃保存备用。采用Bradford方法定量检测裂解液总蛋白浓度，整个裂解过程在冰上操作。采用Bovine 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase ELISA kit(cat.no.CSB-E12140B)，测定肝细胞HMGCS蛋白浓度。采用相对定量方法计算目的蛋白表达水平变化，按下式计算，计算结果及数据统计采用Q值表示。

1.6 数据处理

试验数据全部选用SPSS 13.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。结果采用“平均数±标准差”方式表示,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

如图1所示，随着培养液中BHBA浓度逐渐升高，HMGCS mRNA和蛋白表达水平逐渐降低。与对照组相比（0 mM），低浓度BHBA（≤1.0 mM）对HMGCS mRNA和蛋白表达未产生显著影响（P＞0.05），但当培养液中BHBA浓度达到1.5 mM时，HMGCS mRNA和蛋白表达显著降低（P＜0.05），且随着BHBA浓度不断增加该抑制作用持续增强，呈剂量依赖性。

图1 不同浓度BHBA对肝细胞HMGCS基因表达的影响

3 讨论

BHBA是脂肪酸在肝脏发生不完全氧化所生成的特殊中间产物，血浆BHBA浓度反映了NEFA在肝中进行氧化代谢的能力。正常情况下，肝脏中产生的少量酮体可以作为能量底物供给肝外组织使用，如骨、心肌和肾皮质等。当奶牛肝脏中NEFA不完全氧化产生BHBA的水平超过肝外组织利用BHBA的能力时，大量BHBA就会在血浆、肝脏和外周组织中蓄积，从而引发酮病。目前，国际上普遍将血清BHBA水平作为奶牛酮病的诊断指标。

关于BHBA对肝脏脂肪酸氧化代谢的具体调节机制尚不清楚。有研究表明，高浓度BHBA能够显著抑制犊牛肝细胞肉碱脂酰转移酶Ⅰ(CPTⅠ)、脂酰辅酶A合成酶（ACSL）、柠檬酸合成酶（CS）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）等基因表达，抑制肝脏脂肪酸氧化和合成代谢过程，导致肝脂代谢紊乱。但有关BHBA对其自身合成的调控作用尚未见报道。HMGCS是控制BHBA合成的关键限速酶，其表达受禁食、运动、日粮成分等多种因素调控。Hegardt研究表明，饥饿可以增加HMGCS mRNA和蛋白表达水平，从而导致动物体内BHBA含量升高。本人前期研究结果表明，尽管酮病奶牛血清BHBA水平升高，但肝脏中HMGCS mRNA和蛋白水平仍显著低于健康奶牛，且奶牛血清BHBA浓度与肝组织中HMGCS蛋白水平呈显著负相关，提示HMGCS表达降低可能与高浓度的BHBA有关。本研究结果显示，高浓度BHBA（≥1.5 mM）可以显著抑制肝细胞HMGCS mRNA和蛋白表达，呈剂量依赖性。表明高浓度的BHBA可能对HMGCS具有负反馈调节作用，通过降低HMGCS基因的表达而减少肝脏中BHBA的合成，进一步证实了上述研究结果。

（参考文献12篇，刊略，需者可函索）