抗肠炎功能蛋白对工业化养殖点带石斑鱼生长、水环境和消化酶的效应

■ 周邦维 李 勇 郭培红 于学权 常欣堂 高婷婷 柳 阳

（1.中国科学院海洋研究所，山东青岛 266071；2.山东贝瑞康生物科技有限公司，山东潍坊 261061；3.天津市海发珍品实业发展有限公司，天津 300452；4.海洋生态养殖技术国家地方联合工程实验室，山东青岛 266071）

卵黄抗体作为饲料添加剂其发展迅速，给仔猪、雏鸡、蟹、虾等养殖动物饲喂卵黄抗体，可增加肠绒毛的高度和隐窝深度，并能降低空肠球状细胞和淋巴滤泡的数目[1]；日增重和免疫保护率显著提高，死亡率显著降低[2-3]。本试验采用的抗肠炎功能蛋白是具有抗肠炎效果的卵黄抗体添加剂，其作为一种全新的绿色抗病促长添加剂，以靶器官明确、效果显著、耐高温不易被消化酶分解等特点，已在一些水产养殖动物肠道健康、促生长和提高饲料利用方面取得可喜进展。但对我国正在兴起、前景广阔的现代封闭循环水工厂化养殖海珍鱼类的生理效应和添加技术未进行专门试验，也未见有研究参考报道。

点带石斑鱼（Epinephelus coioides）为辐鳍鱼纲鲈形目鲈亚目鮨科石斑鱼属的鱼类，俗称青石斑，性情凶猛，属肉食性鱼类，其肉质肥美鲜嫩、营养丰富。石斑鱼市场价格不菲，是经济价值较高的海水养殖鱼类。目前虽然对点带石斑鱼的蛋白质等主要营养成分的研究已经比较深入[4-7]，但关于抗肠炎功能蛋白作为配合饲料添加剂用于改善石斑鱼的生长、消化、水质等研究鲜有报道。

本试验研究采用新颖的生态营养学原理和方法，在现代封闭循环海水工厂化养殖条件下，对抗肠炎功能蛋白新产品在膨化颗粒饲料中添加后对石斑鱼生长、消化、水质的作用进行探寻，获得适宜添加量，为“抗肠炎功能蛋白”的推广应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计

采用单因素随机试验设计，设置4个试验处理：分别在基础饲粮中添加0‰、1‰、2‰、3‰的抗肠炎功能蛋白添加剂，形成0#、1#、2#、3#饲粮，即4个不同日粮处理组，每处理4个重复，共计16个试验单元，每单元养殖40条点带石斑鱼幼鱼，试鱼共计640尾。在工业化封闭循环海水养殖条件下，进行115 d试验（正试期105 d，预试期10 d）。

1.2 试验饲料

基础饲料组成及营养成分见表1。试验基础配合饲料的原料，经超微粉碎等处理后达到80目细度，按设计比例混合均匀，在瑞士布勒公司制造的BCTGD62型水产饲料专用双螺杆挤压膨化机上，制成粒径为5 mm的半沉性膨化颗粒饲料，再经烘干、冷却、打包后待用。

表1 基础饲料组成及主要营养成分（%）

抗肠炎功能蛋白添加剂由山东贝瑞康生物科技有限公司提供。在每次饲喂试鱼前3～5 d，将蛋白粉按试验设计比例配成水溶液后，人工拌到基础饲料表面，形成各组试验料，室内晾干待用。

1.3 试验用鱼及饲养管理

试验在天津海发珍品实业发展有限公司进行，试验用鱼来自公司二车间，从来源和批次相同的鱼池中挑选健康、无畸形、体重相近[（64.80±0.56）g]的点带石斑鱼幼鱼640尾，随机分配到16个养殖桶（水高0.6 m，桶径1 m）里，每桶40尾鱼。所有养殖桶的进水都经同一封闭循环水系统过滤、消毒、增氧等处理，水温维持在27～29℃。每天7:40和16:30饱食饲喂两次，记录摄食量及死淘鱼数量等情况。养殖试验过程中根据试鱼摄食情况，及时调整投饵量。试验共进行115 d，结束时停食24 h，使用MS222麻醉石斑鱼后进行称重及解剖取样。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生长指标及测定方法

增重率(WGR,%)=100×(W2-W1)/W1；

特定生长率(SGR,%/d)=100×(lnW2-lnW1)/t；

摄食量(FR,%)=100×C/[(W2+W1)/2]；

饲料系数(FCE)=C/(W2-W1)。

式中：W1——试验开始时每尾鱼的平均湿重（g）；

W2——试验结束时每尾鱼的平均湿重（g）；

C——每尾试验鱼的平均总摄食量(风干重，g);

t——试验天数（d）。

1.4.2 消化酶指标及测定方法

解剖取样得到不同饲料组石斑鱼的肠、胃及肝胰脏组织，样品低温保存，使用南京建成生物工程研究所的标准试剂盒方法，测定蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶活性。

在测定消化酶活性前将组织冰浴匀浆、离心预处理，并通过预试验确定稀释倍数后进行正式测定。

①胃蛋白酶：胃蛋白酶可水解蛋白质产生含酚的氨基酸，把酚试剂还原成蓝色物质，通过比色测定胃蛋白酶活力。

②胰蛋白酶：胰蛋白酶能催化水解底物精氨酸乙酯的酯链，使其在253 nm处吸光度值升高，根据吸光度的变化可以计算出酶的活力。

③脂肪酶：甘油三酯和水制成的胶乳，因其胶束对入射光的吸收及散射而具有乳浊特性。胶束中的甘油三酯在脂肪酶作用下发生水解，使胶束分裂，散射光或浊度因而减低。减低的速率与脂肪酶活力有关。

④淀粉酶：淀粉酶水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖和糊精，在底物浓度已知并且过量的情况下，加入碘液与未水解的淀粉结合成蓝色复合物，测定吸光值推算出水解的淀粉量，从而计算出淀粉酶的活力。

1.4.3 水质指标及测定方法

为了检测不同饲料组石斑鱼生长水质环境，在试验末期对不同饲料组养殖石斑鱼的水质进行测定，连续3 d 13:00定时取水样，并在当天测定水体中氨氮、亚硝酸氮及化学需氧量（COD）。氨氮测定采用纳氏试剂法；亚氮测定采用重氮-偶氮法；COD测定采用优化了的碱性高锰酸钾法，即烘箱加热代替电炉加热。

1.5 统计分析方法

本试验所有数据结果通过统计软件SAS9.1进行方差分析，采用LSD法进行多重比较。显著性水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 生长性能

试验鱼摄食量变化曲线见图1。由图1可见，随着饲粮抗肠炎功能蛋白粉添加量增加，各处理试鱼采食量逐渐上升，组间差异愈来愈明显。尤以3#组优势明显，2#组较好。值得一提的是，从8月期间的2次应激（突然降温、测水质停食）采食变化特征曲线看出，3#、2#组的抗应激效应显著优于0#、1#组，产生了较大组间差异。

图1 抗肠炎功能蛋白粉对工业化养殖点带石斑鱼摄食量效应曲线

试验生长性能结果如表2、图2所示，随着基础饲料中抗肠炎功能蛋白粉添加量的增加，点带石斑鱼的生长速度得到明显改善。平均增重率呈现递增趋势，1#组与对照0#组相比差异不显著，但1#组增重率提高了7.8%(P＞0.05)；2#、3#组分别显著高于对照组9.3%和13.9%(P＜0.05)。1#、2#、3#组饲料系数比对照0#组分别显著降低9.4%、10.3%、12.0%(P＜0.05)。此结果特征与采食变化曲线规律相一致。

表2 抗肠炎蛋白粉对工业化养殖点带石斑鱼生长性能的影响（n=3）

图2 抗肠炎蛋白粉对工业化养殖点带石斑鱼增重率及饲料系数的影响

2.2 养殖水环境

从试验水环境主要指标测定结果(见表3)可见,各组的NO2--N和COD都没有显著差异(P＜0.05),分别维持在0.14 mg/l和3.67 mg/l左右。而不同处理组水质NH3-N出现显著差异,随抗肠炎蛋白粉添加量增加,水环境中氨氮含量出现递增特征。2#、3#组比对照0#组增加28.8%、42.4%(P＜0.01)，比1#组提高23.2%、36.2%(P＜0.05、P＜0.01)，1#组与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。水质指标结果特征也与采食量变化曲线、增重率和饲料系数变化规律相符合。

表3 抗肠炎蛋白粉影响工业化养殖点带石斑鱼水环境主要指标情况（n=3，mg/l）

2.3 消化酶活力

胃消化酶活力测定结果如表4所示，蛋白酶、脂肪酶活力值在肠胃中较低，各试验组间蛋白酶活力差异显著，但与对照组相比变化规律不明显。脂肪酶活力差异不显著，淀粉酶活力值在肠胃中较高，随抗肠炎蛋白添加量提高，出现先升后降的特征，1#、2#组分别极显著和显著高于对照0#组24.1%、10.9%（P＜0.01、P＜0.05），分别极显著高于3#组31.8%、17.7%（P＜0.01）；1#组也显著高于2#组12.0%（P＜0.05），3#组与对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

表4 抗肠炎蛋白粉对工业化养殖点带石斑鱼肠胃消化酶活力的效应（n=3）

试验各组鱼的肝胰脏消化酶活力值（见表5、图3）均较高，脂肪酶活力差异不显著。蛋白酶活力随抗肠炎蛋白添加量提高而显著增加，3#、2#、1#组比对照0#组分别极显著或显著提高56.4%(P＜0.01)、36.1%(P＜0.01)、14.4%(P＜0.05)；3#、2#组比1#组分别极显著或显著提高36.6%(P＜0.01)、19.0%(P＜0.05)；3#组比2#组显著提高14.9%(P＜0.05)。肝胰脏淀粉酶活力变化特征与肠胃相似，随抗肠炎蛋白添加量提高，出现先升后降的趋势，2#组分别显著高于对照0#、3#组10.9%、12.8%(P＜0.05)；1#组分别显著高于对照0#、3#组7.6%、9.5%(P＜0.05)；其余组间差异不显著（P＞0.05）。

表5 抗肠炎蛋白粉对工业化养殖点带石斑鱼肝胰脏消化酶活力的效应（n=3）

图3 抗肠炎蛋白粉对工业化养殖点带石斑鱼肝胰脏蛋白酶、淀粉酶活力的效应

3 讨论

3.1 抗肠炎蛋白粉对生长及应激的效应

抗肠炎蛋白添加剂，主要通过增强消化道健康来提高动物生长性能和改善机体健康状况，这一功能特性在本试验生长性能结果中表现突出。从其生长性能指标变化规律看，随着基础饲料中抗肠炎蛋白粉添加量的增加，点带石斑鱼的生长速度和饲料利用率明显提高，增重率比对照组分别提高了7.8%～13.9%，饲料系数比对照组降低9.4%～12.0%，但添加梯度组间差异不显著。

养殖动物生长期采食量的高低标志着生长快慢，也间接反映机体健康状况。本试验各处理组试鱼全期摄食量变化曲线（图1）显示，随着饲粮抗肠炎蛋白粉添加量增加，各处理试鱼采食量逐渐上升高于对照组，且组间差异愈来愈明显。尤以3#、2#组采食优势明显。特别是试验在8月份连续2次应激（突然降温、测水质停食），使3#、2#组的采食量下降及回升的幅度显著优于0#、1#组，产生了较大组间差异。故本研究的新发现是，饲粮添加2‰以上抗肠炎蛋白粉后，显著增强了鱼的抗应激能力，或者说显著减缓了试鱼应激反应的副作用，使应激后试鱼采食量下降幅度显著减缓，从而有力阻止了生长速度的停止或下降，整体上提高了增重率和饲料利用率。这是抗肠炎蛋白粉提高试鱼生长性能的原因所在。其作用机理是否与减缓肠道疾患从而间接提高机体免疫应激能力有关，还需进一步分析和探究。

鱼类养殖中，经常会出现不同程度和类型的应激，抗应激添加剂在水产饲料中的应用研究颇丰。孙克年[8]总结了以下12种抗应激添加剂：维生素C、核苷酸、腐植酸、海带、甜菜碱、小肽、虾青素、柠檬苦素类似物、肉毒碱盐酸盐、糖萜素、几丁聚糖、中药添加剂。这些添加剂都有增强养殖鱼免疫力、提高存活率、减少病害、提高应激能力的表现。另外，N-乙酰-5-甲氧基色胺能够减小塞内加尔鳎的应激负作用[9]。而鸡蛋卵黄抗体作为一种治疗剂，不仅在治疗人体肠道传染病上有良好效果[10]，在水产养殖鱼饲料上也有应用。比如：卵黄免疫球蛋白能够预防鲫鱼败血症[11]，帮助虹鳟抵抗鲁氏耶尔森菌的入侵[12]；卵黄抗体还能识别太平洋鲑体内发育和成熟的微孢子虫[13]等。本试验证明，抗肠炎蛋白粉显著减缓应激反应副作用的效应，对鱼类养殖生产意义重大，也是该产品推广应用的独特性能所在。

Mahdavi等[1]研究证明，卵黄抗体能降低养殖动物空肠球状细胞和淋巴滤泡的数目；使日增重和免疫保护率显著提高，死亡率显著降低[2-3]。本试验发现，抗肠炎蛋白粉显著减缓试鱼应激反应副作用的结果，与前人研究结果有相似之处。

3.2 抗肠炎蛋白粉对水环境的影响

关于饲料中添加抗肠炎蛋白粉对养殖水环境的影响研究，尚未见有文献报道。本试验结果表明，试鱼采食含有抗肠炎蛋白粉的饲料后，对养殖水的亚硝酸氮（NO2--N）和化学耗氧量（COD）都没有显著影响，而对水氨氮（NH3-N）含量影响较大。随抗肠炎蛋白粉添加量增加，水氨氮含量出现递增特征，2#、3#组比对照0#组极显著增加28.8%、42.4%（P＜0.01），比1#组也显著提高23.2%～36.2%（P＜0.05、P＜0.01）。其原因是，随着抗肠炎蛋白粉添加量递增，试鱼采食量明显递增，尤以2#、3#组采食量提高显著；同时增重率也在递增。2#、3#组采食多、体重大，故排除氨氮量更多一些。水质氨氮指标结果的变化特征与本试验采食量变化曲线相吻合，也与增重率和饲料系数变化规律基本一致。

3.3 抗肠炎蛋白粉对消化酶的作用

抗肠炎蛋白粉等卵黄抗体添加剂对鱼类消化酶效应和作用机制的研究目前尚未见有文献报道。本试验表明，抗肠炎蛋白粉对蛋白和淀粉消化酶产生了显著影响，而对脂肪酶作用不明显。

对蛋白酶的作用主要发生在肝胰脏，随抗肠炎蛋白粉添加量递增，蛋白酶活力显著或极显著递增，提高的幅度范围达14.4%～56.4%，以2‰和3‰添加量的促进效应较高。对淀粉酶的作用，不论是胃肠还是肝胰脏，随抗肠炎蛋白添加量提高，均出现先升后降的特征，1‰和2‰添加量的效应显著，胃肠淀粉酶活力比对照组分别提高了24.1%、10.9%。肝胰脏淀粉酶活力比对照组分别提高7.6%、10.9%。

分析其可能原因为，饲料中添加适宜量的抗肠炎蛋白粉后，减少了试鱼肠道炎症、改善了消化道健康，从而提高了营养物质的消化和吸收，间接刺激了消化酶活力提高。至于其对脂肪酶的效应不明显，其原因有待进一步探寻。

4 结论

①本试验研究发现，饲粮添加2‰以上抗肠炎蛋白粉后，显著降低试鱼应激反应副作用即显著减缓采食量下降幅度，这是抗肠炎蛋白粉提高生长性能的原因所在，对鱼类养殖生产中意义重大。

② 基础饲料中添加1‰～3‰的抗肠炎蛋白粉，明显提高点带石斑鱼的生长性能，增重率和饲料系数比对照组分别提高7.8%～13.9%和降低9.4%～12.0%（P＜0.05）。随抗肠炎蛋白粉添加量增加，水体中氨氮含量出现递增特征。

③本试验表明，抗肠炎蛋白粉对蛋白质和淀粉消化酶活力产生了显著影响，而对脂肪酶活力作用不明显。与对照组相比，肝胰脏蛋白酶活力显著或极显著提高14.4%～56.4%；添加1‰和2‰抗肠炎蛋白粉，胃肠淀粉酶活力分别提高了24.1%、10.9%，肝胰脏淀粉酶活力分别提高7.6%、10.9%（P＜0.05）。

④本试验研究证明，工业化养殖点带石斑鱼幼鱼膨化颗粒饲料中，抗肠炎蛋白粉的适宜添加量为2‰～3‰。