甲型流感病毒感染所致AECOPD与氧化应激的关系

卢文宣,韩伟,唐华平

(青岛大学医学院附属青岛市市立医院东院呼吸科,山东青岛 266071)

甲型流感病毒感染所致AECOPD与氧化应激的关系

卢文宣,韩伟,唐华平

(青岛大学医学院附属青岛市市立医院东院呼吸科,山东青岛 266071)

目的探讨甲型流感病毒感染所致慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)与氧化应激关系。方法选取152例AECOPD病人,采用RT-PCR方法检测病人痰液中甲型流感病毒RNA,甲型流感病毒阳性病人23例(A组),阴性者129例(B组)。比较两组病人痰液中8-异前列腺素(8-isoprostane)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平。结果A组病人痰标本中8-isoprostane水平高于B组,SOD、GSH水平低于B组,差异有统计学意义(t＝16.75～24.33,P＜0.01)。结论甲型流感病毒感染所致AECOPD与人体的氧化应激状态有较强的相关性,这对于指导临床治疗有重要的参考价值。

肺疾病,慢性阻塞性;流感病毒A型;氧化性应激

病毒性上呼吸道感染与慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)有关。采用PCR技术,40%～60%的AECOPD病人的呼吸道分泌物可检出呼吸道病毒,其中最常见的病毒有鼻病毒、流感病毒、副流感病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒以及人偏肺病毒等[1]。近期甲型流感的流行造成许多慢性呼吸系统疾病,尤其是慢性阻塞性肺疾病病人病情恶化、甚至死亡。呼吸道病毒在AECOPD中的作用再次受到各国学者的关注。由于经常变异,目前缺少针对呼吸道病毒感染的有效药物,致使一些病人因为严重的呼吸道病毒感染引起病情恶化。近年来研究发现,病毒感染导致的病情加重与机体广泛的氧化应激反应有关,但有关呼吸道病毒的氧化应激损害研究较少,主要集中在呼吸道合胞病毒,未见有关流感病毒氧化应激的报道[2]。本文旨在探讨甲型流感病毒感染所致AECOPD与机体氧化应激的关系。现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象

2011年11月1日—2012年6月1日,选取入住我科的AECOPD病人152例,男90例,女62例;年龄52～86岁,平均(73.90±9.83)岁;病程3～40年。AECOPD诊断参照《慢性阻塞性肺疾病防治全球倡议》的标准,并符合下列条件:①入院前未接受任何抗生素治疗;②无支气管哮喘病史,吸入沙丁胺醇400μg后FEV1占预计值%的可逆性＜12%;③未合并严重心、肝、肾等系统疾病;④胸部X线片未显示其他肺部疾病。

1.2 仪器和试剂

二流苏糖醇溶液(DTT)、磷酸盐缓冲液(PBS)由康思泰得化学试剂公司提供;RNAiso Plus(Total RNA提取试剂)、PrimeScript Rt Master Mix Perfect Real Time、DL2000 Marker流感病毒引物均由Takara公司生产或合成,PCR扩增试剂盒由上海生工生物工程有限公司生产;低温离心机、常温离心机、PCR仪、凝胶图像分析仪、电泳槽、微波炉、数显恒温水浴锅、隔水式电热恒温培养箱、分光光度计、酶标仪等均由青岛市市立医院中心实验室提供;超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、8-异前列腺素(8-isoprostane)检测试剂盒由南京建成生物有限公司提供。

1.3 研究方法

1.3.1 痰液的处理 取病人入院后次日清晨深咳第一口痰为实验标本,取痰后立即与等体积含1 g/ L DTT的PBS平衡盐溶液混匀,37℃水浴15 min,水浴过程中适当震荡混匀,之后在常温离心机中以3 000 r/min离心10 min,取100μL上清液用于总RNA提取;另取100μL上清液用于氧化应激因子的测定,－20℃冰箱保存备用。

1.3.2 总RNA的提取与反转录 参考文献[3]的方法。

1.3.3 流感病毒的普通PCR扩增 流感病毒引物序列为Forward 5′-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3′,Reverse 5′-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3′,由Takara公司合成。反应体系如下:10×PCR Buffer 2.5μL,d NTP Mix 2.5μL,上、下游引物各1μL,pfu DNA Polymerase 0.2μL,模板DNA 1μL,Sterilized dd H2O补足至25μL。反应参数:95℃10 min,95℃15 s,55℃31 s,72℃30 s,共35个循环。每次扩增均设立阳性对照和阴性对照。

1.3.4 8-isoprostane、SOD和GSH测定 SOD测定采用WST-1法,8-isoprostane测定采用ELISA法,GSH测定采用酶标微板法。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 痰液中提取总RNA常规PCR扩增

痰液中提取的总RNA电泳验证提取成功,见图1。将提取出的总RNA进行反转录和PCR扩增,将扩增产物进行DNA电泳,结果在108 bp处可见亮带,与预期的扩增产物大小一致。见图2。

2.2 两组痰液中SOD、GSH和8-isoprostane水平比较

甲型流感病毒阳性病人23例(A组),阴性者129例(B组)。A组痰液中8-isoprostane水平高于B组,SOD、GSH水平低于B组,差异有统计学意义(t＝16.75～24.33,P＜0.01)。见表1。

表1 两组痰液中GSH、SOD、8-isoprostane水平比较(±s)

与A组比较,＃t＝16.75～24.33,P＜0.01。

组别n GSH (ρ/mg·L－1)___ SOD (z/k U·L－1)___ 8-isoprostane (ρ/ng·L－1)_ A组23 255.28±46.69 52.01±7.41 158.92±23.41 B组129_350.98±43.73＃_____82.23±6.31＃______89.75±12.03＃

3 讨 论

AECOPD的早期多为病毒感染,如果在病毒感染48 h之内得不到及时有效的控制,多继发细菌感染,但是病毒感染和普通细菌感染对AECOPD的发生、病情、预后以及治疗的影响均有明显差异。与没有病毒参与的AECOPD相比较,伴有病毒感染的AECOPD病人的临床症状评分更高,痰和血液中的炎症因子水平更高,中位恢复时间更长,发作也更频繁[4-5]。在发病早期及时抑制病毒的复制显得至关重要。而目前检测病毒抗体的实验易出现一些假阴性和假阳性,从而限制了抗病毒药物在AECOPD中的应用。因此,积极地寻求其他的检测手段和治疗手段成为近几年来研究的热点。

YATMAZ等[6]研究显示,甲型流感病毒感染的小鼠肺组织中GSH、Vc和Ve浓度下降,提示体内氧化应激发生改变。而且抗氧化剂对流感病毒感染也有治疗的作用。ODA等[7]报道,用吡喃聚合物连接SOD,可保护小鼠抵抗致死剂量甲型流感病毒的作用,治疗组存活。

本课题组欲通过研究病毒引发的病理生理损害,并阻断其中关键步骤来达到抑制病毒复制的目的。本研究结果显示,流感病毒感染所致AECOPD病人痰液中氧化产物8-isoprostane水平高于流感病毒阴性组,且抗氧化产物SOD、GSH水平低于流感病毒阴性组,即甲型流感病毒感染病人氧化产物的活性较对照组高,抗氧化物的活性较对照组低,这与YATMAZ等[6]的研究结果一致。说明流感病毒感染的人体存在氧化应激损伤,故在发病早期或流感病毒高发季节积极应用抗氧化药物,抑制病毒复制,理论上可以降低AECOPD的患病风险,这有待进一步的深入研究及临床验证。

钟南山[8]曾提出,慢性阻塞性肺疾病病死率居高不下,其中一个重要的原因就是缺乏对慢性阻塞性肺疾病早期诊断的敏感性和特异性评估指标或标记物。有研究表明,降钙素原(PCT)定量监测可作为评估AECOPD合并细菌感染的早期指标[9]。希望本研究对AECOPD病人氧化应激因子的监测能引起大家的重视,为临床医生诊断AECOPD合并病毒感染提供一些指导,在AECOPD早期积极进行干预,以延缓疾病进展。郝敏等[10]已做过慢性阻塞性肺疾病大鼠模型其他氧化指标的检测,其参考价值也是肯定的。呼吁临床医师转变对慢性阻塞性肺疾病病人的治疗理念,将治疗慢性阻塞性肺疾病的重点像治疗冠心病、高血压、糖尿病一样放在早发现、早诊断、早干预等环节。

[1]VARKEY J B,VARKEY B.Viral infections in patients with COPD[J].Cur Opinion Pulm Med,2008,14:89-94.

[2]TAKAAKI A,SHIGEMOTO F,ATSUSHI K,et al.Viral mutation accelerated by nitric oxide production during infection in vivo[J].The FASEB Journal,2000,14(10):1447-1454.

[3]甄莉宏,陈云天,陈小东,等.慢性阻塞性肺疾病稳定期患者呼吸道合胞病毒感染与气道炎症的关系[J].中国老年学杂志, 2010,30:2900-2902.

[4]SEEMUNGAL T,HARPER-OWN R,BHOWMIK A,et al.Respiratory viruses,symptoms,and inflammatory markers in acute exacerbations and stable chronic obstructive pulmonary disease[J].Am J Respir Crit Care Med,2001,164:1618-1623.

[5]ROHDE G,WIETHEGE A,BORG I,et al.Respiratory viruses in exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease requiring hospitalization:a case-control study[J].Thorax, 2003,58:37-42.

[6]YATMAZ S,SEOW H J,GUALANO R C,et al.Glutathione Peroxidase-1(GPx-1)reduces influenza A virus-induced lung inflammation[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2013,48 (1):17-26.

[7]JACOBY D B,CHOIAM K.Influenza virus induces expression of antioxidant genes in human epithelial cells[J].Free Radic Biol Med,1994,16:821-824.

[8]钟南山.早发现、早诊断和早干预应是我国慢性阻塞性肺疾病防治的主要方向[J].中华结核和呼吸杂志,2012,35(4):243-245.

[9]陈恩竹,田刚,于文成.慢性阻塞性肺疾病病人血清PCT和HBD-2水平变化及意义[J].青岛大学医学院学报,2012,48 (3):259-260.

[10]郝敏,韩伟忠,程兆忠,等.低分子肝素对COPD模型大鼠肺组织HIF-1α、HO-1、VEGF表达的影响[J].齐鲁医学杂志, 2012,27(3):233-235.

(本文编辑 马伟平)

RELATIONSHIP BETWEEN ACUTE EXACERBATION OF CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE INDUCED BY IN-FLUENZA A VIRUS INFECTION AND OXIDATIVE STRESS

LU Wenxuan,HAN Wei,TANG Huaping (The Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266071,China)

ObjectiveTo study the relationship between acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (COPD)caused by influence A virus(flu-A virus)and oxidative stress.MethodsThis study consisted of 152 patients with acute exacerbation of COPD-flu-A virus positive 23 patients(group A),and negative 129 patients(group B)－the RNA of flu-A virus in sputum was detected by using RT-PCR,the levels of 8-isoprostane,SOD,and GSH in sputum were compared between the two groups.ResultsThe level of 8-isoprostane in group A was higher than group B,and that of SOD and GSH lower,the differences being significant(t＝16.75－24.33,P＜0.01).ConclusionAcute exacerbation of COPD due to flu-A virus infection is strongly correlated with oxidative stress state of the organism,which is of important reference value in guiding clinical therapy.

pulmonary disease,chronic obstructive;influenza A virus;oxidative stress

R563

A

1008-0341(2013)04-0351-03

10.11712/qlyx201304023

2013-01-16;

2013-05-10

青岛市公共领域科技支撑计划资助项目(10-3-3-4-3-nsh)

卢文宣(1984-),女,硕士研究生。

唐华平(1963-),男,主任医师,硕士生导师。