白三烯C4合成酶基因多态性与缺血性脑卒中关系

孙瑛,李海先,吴海容,侯树刚,周畅,张晨

(青岛大学医学院附属医院神经内科,山东青岛 266003)

白三烯C4合成酶基因多态性与缺血性脑卒中关系

孙瑛,李海先,吴海容,侯树刚,周畅,张晨

(青岛大学医学院附属医院神经内科,山东青岛 266003)

目的探讨白三烯C4(LTC4)合成酶基因启动子区rs730012(-444A/C)位点多态性与缺血性脑卒中(IS)的相关性。方法应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)及凝胶电泳技术,检测IS组和与其性别及年龄相匹配的健康对照组LTC4合成酶基因启动子区rs730012位点多态性,并比较两组基因型、等位基因频率的差异。采用Logistic回归去除传统危险因素的影响,分析其基因型、等位基因频率与IS发病相关性。结果IS组rs730012位点非携带C等位基因(AA基因型)人群患IS的风险约是携带C等位基因(AC＋CC基因型)人群的1.6倍(OR＝1.636,P＜0.05)。结论LTC4合成酶基因rs730012位点多态性可能与IS发病相关,等位基因A可能是其风险等位基因。

白三烯C4;脑血管意外;多态性,单核苷酸

脑卒中是严重危害人类健康的疾病,会造成严重残疾。缺血性脑卒中(IS)约占卒中的70%,是临床上最常见的脑卒中类型。IS的病理学基础为动脉粥样硬化。研究表明,白三烯(LTs)与动脉粥样硬化有关,并能增加心血管疾病患病率[1]。LTs通过花生四烯酸(AA)经氧化代谢途径形成。磷脂膜释放AA,经过氧化、脱水生成白三烯A4(LTA4)。LTA4能转化为白三烯B4(LTB4)或有血管收缩、致炎作用的半胱氨酸白三烯(Cys LTs),后者包括白三烯C4(LTC4)、白三烯D4(LTD4)和白三烯E4 (LTE4)。Cys LTs不仅广泛参与多种炎症病理过程,而且参与脑卒中、脑外伤等中枢神经系统的病理过程。LTC4合成酶是LTs合成Cys LTs通路的一种关键酶。研究表明,女性LTC4合成酶启动子区的-444A/C易位与冠状动脉钙水平升高和平均颈动脉内膜中层厚度增加有关[2]。目前就LTC4合成酶启动子区基因多态性与IS的相关性国外研究较少,且缺乏大规模研究,而国内尚未有中国人群的大规模病例-对照研究。因此,有必要对LTC4合成酶与IS相关性进行进一步探讨。本研究对LTC4合成酶基因启动子区的rs730012(-444A/C)位点多态性进行检测,旨在探讨该基因多态性与IS的相关性。现将结果报告如下。

1 对象和方法

1.1 研究对象

IS组选自2010年10月—2012年5月我院神经内科住院的病人,共376例,男247例,女129例;平均发病年龄为(65.45±9.01)岁。纳入标准:①符合1995年中华医学会第四届脑血管会议修订的各类脑血管疾病诊断要点,经严格的神经系统体格检查及颅脑CT或MRI扫描确诊;②符合文献[3]中TOAST分型,其中大动脉粥样硬化性脑卒中(LAA型)315例,小动脉闭塞性脑卒中(SVD型)61例。排除标准:脑出血、蛛网膜下隙出血、血管炎性疾病、血液病、药物、恶性肿瘤、血管畸形等引起的脑梗死。对照组为同期我院体检中心查体的健康人,共297例,其中男192例,女105例;平均年龄(64.9±8.55)岁;其性别、年龄等与IS组匹配,经详细的病史询问及系统的体格检查后,排除心脑血管病史及神经系统症状,确认为正常健康人。所有研究对象均有完整的临床资料并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取 采集受检者清晨空腹静脉血3 m L,置于EDTA抗凝管中,应用Promega公司全基因组DNA提取试剂盒提取DNA,并用核酸分析仪测定DNA浓度。

1.2.2 引物设计 根据LTC4合成酶基因启动子rs730012位点多态性和已知的DNA序列,参考文献设计PCR引物。上游引物5′-TGCGGGGCAGAAAGACAC-3′,下游引物5′-TGCTGCACCACCCCACTT-3′。

1.2.3 PCR反应条件 DNA模板1μL,Taq PCR Master Mix 5μL,上、下游引物各0.2μL,灭菌蒸馏水3.6μL,共10μL。反应条件:95℃预变性5 min; 94℃变性45 s,58℃退火45 s,72℃延伸45 s,共35个循环;最后72℃延伸10 min。

1.2.4 酶切反应 PCR产物用MspI限制性内切酶消化。酶切反应体系:MspI限制性内切酶0.3μL, Buffer 1μL,PCR产物3μL,灭菌蒸馏水5.7μL,共10μL。置于37℃温箱内14 h进行酶切反应。反应产物经40 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型。取部分样本测序以确定酶切结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行数据处理及统计学分析。计量资料比较采用独立样本的t检验,计数资料比较采用卡方检验,P＜0.05为差异有显著性。应用多因素Logistic回归分析计算OR值及95% CI。所研究位点的基因型分布经分析符合Hardy-Weinberg平衡,具有群体代表性。

2 结 果

2.1 酶切结果判定

样品经PCR扩增,限制性内切酶切割后电泳,产生AA、AC、CC等3种基因型。见图1。

2.2 两组基因型及等位基因频率比较

两组rs730012位点基因型分布差异有显著性(χ2＝9.361,P＜0.05)。IS组AA基因型分布频率显著高于对照组(χ2＝4.293,P＜0.05)。IS组A等位基因频率明显高于对照组,C等位基因频率明显低于对照组(χ2＝7.491、7.491,P＜0.05)。LAA型病人基因型分布与对照组相比差异具有显著意义(χ2＝9.092,P＜0.05),A等位基因频率显著高于对照组,C等位基因频率显著低于对照组(χ2＝8.117、8.117,P＜0.05);SVD型病人基因型及等位基因分布与对照组相比差异无显著性。见表1。

2.4 多因素Logistic回归分析

经多因素Logistic回归分析,在去除吸烟、高血压、糖尿病、HDL的影响之后,rs730012位点非携带C等位基因(AA基因型)人群患IS的风险约是携带C等位基因(AC＋CC基因型)人群的1.6倍(OR＝1.636,P＜0.05)。LAA型rs730012位点非携带C等位基因人群患IS的风险约是携带C等位基因人群的1.7倍(OR＝1.748,P＜0.05)。见表2。

3 讨 论

LTs有很强生物学活性,广泛参与多种炎症性病理过程。近年来,5-脂氧合酶-LT途径在动脉粥样硬化过程中的作用已受到重视[4],该途径引起的炎症反应在动脉粥样硬化的发展中起重要作用。通过LT途径的AA代谢起始于免疫、变态反应或者炎症刺激,5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)选择性运输AA并促进其经氧化、脱水作用生成LTA4。LTC4是LTC4合成酶催化LTA4与谷胱甘肽结合的产物,经转化形成LTD4和LTE4。LTC4与LTD4、LTE4统称为Cys LTs。Cys LTs可改变内皮细胞通透性,促进白细胞在动脉壁聚集,导致血管重塑以及血栓形成。大鼠局灶性脑缺血后Cys LTs含量迅速增加,FLAP抑制剂可以抑制Cys LTs释放,从而减少脑梗死体积[5]。因此,Cys LTs被认为参与了某些炎症反应及中枢神经系统疾病的病理进程。

LTC4合成酶是LTs合成Cys LTs通路的一种关键酶。LTC4合成酶基因位于人类第5号染色体(5q35)上,该基因包括5个外显子及6个内含子。SANAK等[6]在LTC4合成酶基因的启动子区发现了一个单核苷酸多态性(SNP)位点-444A/C,该位点可能增加人群阿司匹林不耐受性哮喘的患病率。BEVAN等[7]检测了LT合成途径和受体的基因变异与IS及亚型的关系,结果显示LTC4合成酶基因(rs730012)变异可使小血管性卒中的发病风险增加1.5倍。FREIBERG等[8]认为,LTC4合成酶SNP位点CC基因型可减少脑血管病的患病风险。

本实验通过对IS组和对照组受试者LTC4合成酶基因启动子区rs730012位点基因型及等位基因的比较,发现其差异均有显著性。LTC4合成酶基因启动子区rs730012(-444A/C)基因多态性与IS的发生相关。与对照组相比,IS组AA基因型及A等位基因的频率明显增高,携带AA基因型的人群IS发病风险增高。应用Logistic回归分析去除影响因素后,其差异仍有显著性,尤其在LAA型病人中。而在SVD型病人中并无明显差异。本结果提示,A等位基因增加IS的发病风险,而C等位基因可能在IS的发病过程中起保护作用。其确切机制尚不明确。既往研究显示,rs730012位点参与基因转录调节过程[9],结合本研究结果,提示A等位基因可能促进了LTC4的高表达,使细胞产生较多Cys LTs,短期内引起血管平滑肌内膜及中膜增殖,从而促进动脉粥样硬化的形成[10];同时,过量的LTC4会增强血管内皮细胞的黏附,加重动脉粥样硬化的炎症反应,导致管腔狭窄、斑块不稳定,最终发生IS并促使其进展[11]。但本文的研究结果与BEVAN等[7]的结果并不完全一致,其原因可能是种族、地域和实验样本选择等因素存在差异。此外,由于条件限制,没有测定研究人群血中LTs浓度,如能对血中LTs浓度进行测定,会更好地理解该基因位点变异参与IS发病的机制,该问题有待于今后进一步研究。

综上所述,本研究LTC4合成酶基因启动子区rs730012位点基因多态与IS有相关性,其A等位基因可能增加患IS的风险,而等位基因C可能是IS发病的保护性因素,但其确切机制尚不明确,有待于进一步研究。

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[7]BEVAN S,DICHGANS M,WIECHMANN H E,et al.Genetic variation in members of the leukotriene biosynthesis pathway confer an increased risk of ischemic stroke:a replication study in two independent populations[J].Stroke,2008,39 (4):1109-1114.

[8]FREIBERG J J,TYBJAERG-HANSEN A,SILLESEN H,et al.Promoter polymorphisms in leukotriene C4 synthase and risk of ischemic cerebrovascular disease[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(5):990-996.

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[11]王鹏飞,赵仁亮,王国峰,等.颅内动脉狭窄对进展性卒中的影响[J].青岛大学医学院学报,2010,46(5):457-459,462.

(本文编辑 厉建强)

ASSOCIATION BETWEEN LEUKOTRIENE C4 GENE POLYMORPHISMS AND CEREBRAL ISCHEMIC STROKE

SUN Ying, LI Haixian,WU Hairong,HOU Shugang,ZHOU Chang,ZHANG Chen (Department of Neurology,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo elucidate the relationship between leukotriene C4 synthetase rs730012(-444A/C)gene polymorphism and cerebral ischemic stroke(CIS).MethodsWith polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)and agarose gel electrophoresis techniques,the leukotriene C4 synthetase rs730012 gene polymorphism in CIS group and in age-and sex-matched control group were detected and compared in terms of the differences of genotype and allele frequency between the two groups.The association of the gene polymorphism and the occurrence of CIS was analyzed by logistic regression to adjust confounding variables.ResultsLogistic regression analysis showed that population with AA genotype of rs730012 had a 1.6-fold higher risk of suffering from CIS than those with AC＋CC genotypes(OR＝1.636,P＜0.05).ConclusionThe polymorphisms of rs730012 in leukotriene C4 synthetase may be related to CIS.Allele A is probably the risk allele.

leukotriene C4;cerebrovascular accident;polymorphism,single nucleotide

R743

A

1008-0341(2013)04-0328-03

10.11712/qlyx201304015

2013-03-07;

2013-06-01

山东省自然科学基金项目(ZR2010HM061)

孙瑛(1987-),女,在读硕士研究生。

张晨(1957-),男,教授,博士生导师。