高效液相色谱-示差折光检测技术研究进展*

2013-02-20，,2，,2，,2，,2，

家畜生态学报 2013年7期

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(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600;2.山东绿都安特动物药业有限公司，山东滨州 256600)

示差折光检测器(Refractive Index Detector，RID)是一种高度稳定和灵敏的液相色谱和凝胶渗透色谱用检测器。其原理是通过比较折光率的变化来检测流动相中的样品峰。对于只有紫外末端吸收的物质，用紫外检测时灵敏度相对较低，同时易发生基线漂移，而用示差折光检测器时可取得较为理想的结果，如聚合物、糖、有机酸等。目前HPLC-RID检测物质含量多应用于医药及食品行业，本文就示差折光检测器在药物含量检测方面的应用进行综述，以利于示差折光检测技术的更广泛应用奠定基础。

1 皂苷元含量测定

传统的皂苷元含量测定多采用薄板层析配合薄板扫描方法或比色法。前者无法分离某些结构相似的皂苷元成分，难以做到对单一组分的定性、定量测定，后者也只能对总皂苷元的相对含量进行测定，应用中受到较大限制。高效液相色谱配示差折光检测器作为近年来发展起来的研究方法，具有高效率、高精密度、高灵敏度等优点，已经在各领域得到了广泛的应用。

采用反相高效液相色谱配示差折光检测器(Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC-RID)法对知母不同炮制品中萨尔萨皂苷元进行分离分析,样品用乙醇提取后采用氯仿进行萃取，发现生品、清炒、盐炙、酒炙及麸炒品中萨尔萨皂苷元含量分别为1.219%、1.344%、1.772%、1.275%和1.519%。采用RP-HPLC-RID法建立了复方知母胶囊中菝葜皂苷元的含量测定方法。当以纯甲醇为流动相，被测定峰与杂质峰分离度良好，线性范围为1.0～7.0 μg，平均回收率98.66%。采用RP-HPLC，利用C18柱和RID比较了蒺藜全草和果实中主要甾体皂苷元的含量差异,证实全草与果实中的海可皂苷元含量相近，而替告皂苷元含量有极显著差异(P<0.01)，从而确定替告皂苷是蒺藜全草的主要指标成分。

2 内酯含量测定

银杏中含有丰富的黄酮类成分，另有萜类、酚类以及多种微量元素、维生素和氨基酸等，在防治心血管病、抗老防衰、保护肌肤、抗癌、抗菌、抗过敏有很好的疗效。其中含有的黄酮类和内酯类成分均有较强的紫外吸收，且黄酮类紫外吸收大于内酯类，因此，测定其中的内酯类成分时，多运用RID方法，其原理系利用样品与流动相折光率不用而检测样品，具有通用性强、操作简便及对黄酮类响应低等优点。王淑君等[1]测定了银杏叶缓释胶囊中银杏内酯的含量，白果内酯及银杏内酯A、B、C在10～80 mg/L浓度范围内均呈良好的线性关系，获得了较高的灵敏度。采用HPLC-RID测定银杏总内酯注射液中银杏总内酯的含量，以Dikama Diamosil C18为色谱柱，流动相为甲醇-水(35:6),表明白果内酯在0.206～2.060 mg/mL、银杏内酯A在0.150～1.500 mg/mL、银杏内酯B在0.102～1.020 mg/mL、银杏内酯C在0.056～0.560 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。同时该方法具有操作简便，灵敏度高，重复性好等优点。商军等[2]采用HPLC-RID法对天然甜菜碱(三甲胺乙内酯)的含量进行测定，在2.005～10.026 mg/mL浓度范围内呈良好的线性关系，回收率达98.8%，与GB/T 2515-2008《饲料添加剂天然甜菜碱》中的离子色谱和高氯酸滴定方法相比，该方法具有快速、简便、适用性强等优点，适用于饲料添加剂中天然甜菜碱的含量测定。

3 糖类成分含量测定

3.1 单糖含量测定

柯云翠等[3]以钙型强酸性阳离子交换树脂为固定相，采用HPLC-RID对复方甘露醇注射液中甘露醇和葡萄糖的含量进行检测，甘露醇在0.15～15 mg/mL范围内呈良好的线性关系，平均回收率为100.1%；葡萄糖在0.05～5 mg/mL范围内呈良好的线性关系，平均回收率100.1%。周礼玲等[4]建立了HPLC-RID法同时测定替硝唑与葡萄糖含量的方法。该方法采用氨基键合硅胶色谱柱，替硝唑和葡萄糖分别在0.10～0.50 g/L和1.25～6.25 g/L浓度范围内呈良好的线性关系，平均回收率为100.3%和99.8%，测定结果与药典方法一致，但可省去药典中两种物质分别测定的繁琐，可以简便、快速、准确的测定样品的含量，有利于药品的快速检测。

3.2 寡糖含量测定

邱建国等[5]建立了地黄寡糖简便有效稳定的测定方法。采用NH2-C18色谱柱分离，示差折光检测器检测测定地黄中寡糖。结果表明，水苏糖在0.0978～0.3260 mg时呈良好的线性关系，回收率达99.43%。采用RP-HPLC-RID建立了保健品中蔗糖、棉子糖和水苏糖的含量测定方法，以Zorbax NH2为色谱柱，蔗糖、棉子糖和水苏糖的线性范围分别为2.38～23.8、2.04～20.4、2.24～22.4 μg/mL，加样回收率分别为96.4%、97.5%和97.4%。邱建国等[6]考察河南新乡、西峡、三门峡、温县、淮阳以及甘肃庆阳、清水、金崖、大康营等地的生地黄中所含地黄寡糖和梓醇的含量。采用水为溶媒，超声提取糖类成分，NH2色谱柱分离，示差折光检测器检测测定；采用甲醇为溶媒，超声提取梓醇，C18色谱柱分离，210 nm处测定紫外吸收值。结果发现，不同产地生地黄中梓醇成分的含量差异则不是很大，其中甘肃产地的相对较高。水苏糖量最高，产地不同，有所差异，所有产地均含有棉子糖，量相对较高，水苏糖与棉子糖含量呈正比关系，各地甘露三糖含量较低，部分地区生地中甚至无甘露三糖。该结论进行的HPLC法测定地黄及含地黄成药中寡糖所得结论一致。邱建国等[7]采用NH2-硅胶色谱柱分离考察了河南新乡、西峡、三门峡、温县、淮阳以及甘肃庆阳、清水、金崖、大康营等地的生地及炮制所得熟地中含地黄寡糖的量，以棉子糖、甘露三糖和水苏糖为考核指标。结果发现，生地黄中水苏糖量最高，产地不同，有所差异，所有产地均含有棉子糖，量相对较高，水苏糖与棉子糖含量呈正比关系，而各地甘露三糖含量较低，部分地区生地中甚至无甘露三糖。

3.3 多糖成分及含量测定

田艳玲等[8]采用示差折光分析法测定饮料中果糖、葡萄糖、蔗糖含量。色谱柱为AgilentCar-bohydrate，流动相为乙腈-水(75:25)。该方法的检出率0.5%，加标回收率92.0%～110.0%，相对标准偏差为4.13%。欧阳华学等[9]采用示差折光法建立了同时测定枸杞中单糖和低聚糖的方法。鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖在10.0～400.0 mg/L范围内，质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系，相关系数r=0.9976～0.9998。精密度RSD分别为2.15%、1.49%、1.09%、3.82%、4.65%，加标回收率为92.27%～101.93%，该方法的检出限分别达到4 mg/kg、5 mg/kg、4 mg/kg、6 mg/kg、5 mg/kg。梁蔚阳等[10]建立同时测定注射用转化糖中果糖与葡萄糖含量的高效液相色谱示差折光检测法。采用氨基键合硅胶柱(250 mm,4.6 mm,5 m)，流动相为乙腈-水(85:15)，结果发现，果糖和葡萄糖分别在0.1266～0.8861 mg和0.1263～0.8842 mg浓度范围内呈良好的线性关系，回收率分别为99.8%和99.7%。颜军等[11]建立了用示差折光高效液相色谱法测定复方胃蛋白酶颗粒中葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的方法。选用色谱柱为Sugar-D，流动相为乙腈-水(78:22，V/V)。结果表明，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖能较好分离，在0.50～10.00 mg/mL范围内线性关系良好；葡萄糖回收率为94.3%～103.7%，蔗糖回收率为101.4%～105.1%；经不确定度评价合成不确定度为1.92%，扩展不确定度为4.1%。该方法简单、准确、稳定、可靠，可用于复方胃蛋白酶颗粒中葡萄糖、蔗糖的含量测定。张进杰等[12]以市售淡水鱼为试材，建立水产品中还原糖(葡萄糖、核糖)、磷酸化糖(磷酸化核糖和磷酸化葡萄糖)和蔗糖的定性、定量检测方法。用乙醇/水提取鱼肉中各糖物质，经树脂吸附处理后，对鱼肉中各糖物质进行分析。结果显示，各糖物质分离效果较好，各物质线性关系良好，回收率在70.2%～98.5%之间，重复性RSD均小于5%。刘潇潇等[13]采用HPLC-RID法建立了同时测定参芪扶正注射液中葡萄糖、果糖和蔗糖含量的方法。果糖、葡萄糖和蔗糖进样量分别在19.1～127.3(r=0.9998)、15.9～106.5(r=0.9996)和6.5～43.5 μg(r=0.9996)范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系；平均加样回收率分别为97.3%、99.2%和95.6%，RSD分别为4.2%、4.4%、5.2%，操作简便，可用于参芪扶正注射液的质量控制。刘泰然等[14]将保健食品经水提取，在沸水浴中用硫酸水解，用氢氧化钠调成中性后以乙腈+水(70:30)为流动相，通过氨基柱分离后用示差折光检测器检测，同一样品在水解前后木糖含量的差值即为样品中低聚木糖的含量。木糖浓度在0.30～4.50 mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，相对标准偏差1.86%～3.80%。

银杏外种皮多糖(Ginkgobilobaexocarppolysac-charides, GBEP)是从银杏种实的外种皮中提取制得的，具有抗肿瘤及增强机体免疫功能等生物学活性。其中含有蛋白质结构部分，还含有少量单糖，而单糖在紫外检测器中几乎无吸收峰，多糖的吸收峰也很小，而在示差折光检测器中能有效地将各种组分分离。鲁萍等[15]采用示差折光检测器测定银杏外种皮多糖的分子质量及含量，以葡聚糖为标样，PLaquagel-OHMIXED(7.5 mm×300 mm,8 μm)为色谱柱，发现银杏外种皮多糖的分子质量为11062.5，RSD为0.78%(n=6)；含量为68.7%，RSD为3.4%(n=6)，葡聚糖(分子质量为12000)在1～20 μg呈良好线性关系(r=0.9999)，平均加样回收率为97.9%，RSD为2.5%。郭守军等[16]利用配示差折光检测器的高效液相色谱外标法直接分离分析半乳甘露聚糖胶中单糖的组成，木糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖的分离可在20 min内完成，检测限分别为2.0 μg、20 μg、1.0 μg和20 μg，线性范围为2～10 mg/mL。

4 其他药物成分测定

张佩军等[17]用高效液相色谱法测定了霍胆丸的含量，猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸在20～99.96 μg范围内，峰面积与进样量呈良好的线性关系，甲氧回收率分别为99.58%和99.39%。池玉梅等[18]采用示差折光检测器检测黄芪及黄芪精口服液中黄芪甲苷的含量，在1～5 μg范围内，结果均呈良好的线性关系，加样回收率分别为98.3%和98.1%。与紫外检测法相比较，该方法灵敏度更高，同时消除了紫外检测法由于黄芪甲苷的检测波长在末端吸收而存在的干扰大的问题。顾振宇等[19]用甲醇超声提取虫草素、水超声提取虫草酸，再用高效液相色谱、示差折光检测器与紫外检测器串联的方法测定虫草素和虫草酸含量。二者检出限分别为50 ng/mL和1.5 μg/mL，回收率在90%～101%之间。

5 展望

随着人们对食品安全问题的日益重视，中药在兽医临床获得了广泛应用，但目前大部分成分尚无含量测定方法。作为一种高度稳定、灵敏的通用型检测器，示差折光检测器具有广泛的使用范围，可弥补紫外检测器的不足，在聚合物、糖类、有机酸、甘油三酸酯、高分子化合物、脂肪烷烃等物质测定方面具有独特的优势，已成为一种重要的分离分析技术，在畜牧兽医领域具有广阔的发展前景。

参考文献：

[1] 王淑君, 彭缨, 李钢, 等. 高效液相色谱法测定银杏叶缓释胶囊中银杏内酯的含量[J]. 中国医院药学杂志, 2004,24(3):148-150.

[2] 商军, 王蓓. 高效液相色谱-示差折光法测定天然甜菜碱含量[J]. 饲料工业, 2010, 31(21): 42-45.

[3] 柯云翠, 朱义. HPLC-RI测定复方甘露醇注射液中甘露醇、葡萄糖的含量[J]. 中国现代应用药学杂志, 2009, 26(3):245-247.

[4] 周礼玲, 张新芹. 高效液相色谱-示差折光检测器法同时测定替硝唑葡萄糖注射液中替硝唑与葡萄糖的含量[J]. 数理医药学杂志, 2011,24(6): 745-747.

[5] 邱建国, 张汝学, 贾正平, 等. 地黄中寡糖含量的HPLC法测定[J]. 中国实验方剂学杂志, 2009,15(8):8-9.

[6] 邱建国, 张汝学, 贾正平, 等. HPLC测定不同产地生地黄中地黄寡糖和梓醇的含量[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(17):110-113.

[7] 邱建国, 贾正平, 张汝学, 等. 生地与熟地中糖类和梓醇的比较研究[J]. 中草药, 2010, 41(7):1 117-1 119.

[8] 田艳玲, 王浩, 刘艳琴, 等. HPLC示差折光分析法测定饮料中果糖、葡萄糖、蔗糖含量[J]. 中国食品添加剂, 2006(6): 187-189.

[9] 欧阳华学, 黎源倩, 肖全伟. 高效液相色谱法同时测定枸杞中单糖和低聚糖的含量[J]. 四川大学学报: 医学版, 2007,38(6): 1 040-1 042.

[10] 梁蔚阳, 冯炜菁. 高效液相色谱-示差折光检测法测定注射用转化糖中果糖与葡萄糖的含量[J]. 中国生化药物杂志, 2007,28(2): 116-117.

[11] 颜军, 谢贞建, 何钢, 等. 示差折光高效液相色谱法测定复方胃蛋白酶颗粒中的糖[J]. 食品科学, 2011,32(22): 248-250.