冷冻保护剂对猪精液的冷冻保护作用*

王春伟，高 璞，苏泽智，李青旺，杨公社，胡建宏*

(1.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.白水县动物疫病控制预防中心,陕西 白水 715600)

1956年，Polge率先利用冷冻猪精液人工授精，并获得仔猪，开启了猪精液冷冻技术研究的序幕。虽然对猪精液冷冻的研究经过了几十年的发展，但迄今利用冷冻精液进行人工授精的应用不足1%，与牛冷冻精液的应用相比仍然存在很大差距。其中的主要原因是猪精子对低温非常敏感，且冷冻-解冻过程中精子的功能极易遭受机械性损伤以及溶液性损伤。此外，由于目前猪冷冻精液采用小剂量包装，人工授精时一次输精剂量不能满足精子数量的要求，因而严重制约了冷冻精液的应用与推广。冷冻保护剂在精液冷冻保存过程中，对精子的冷冻效果至关重要。自从甘油用作精子冷冻保护剂后，家畜精液冷冻技术得到迅速发展。本文通过分析渗透性和非渗透性冷冻保护剂的作用机理及应用情况，为猪精液的冷冻保存研究和应用提供参考，以便促进猪精液冷冻技术的发展。

1 渗透性冷冻保护剂的保护作用

渗透性冷冻保护剂大多是一些小分子物质，能够穿入细胞膜而渗透到细胞内，降低溶液中电解质的浓度，减轻冷冻-解冻过程中细胞渗透性肿胀，避免细胞脱水皱缩。渗透性冷冻保护剂主要有甘油、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)、木糖醇、乙酰胺、阿东糖醇等。甘油是目前应用最为广泛的一种冷冻保护剂，对精子既有保护作用，又有毒害作用。甘油可以浓缩或结合细胞内的水分，降低溶液中电解质的浓度和渗透压。开发新型冷冻保护剂替代或者部分替代甘油是当前冷冻保护剂研究的趋势。Bianchi等[1]研究了二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)和甲基甲酰胺(NMF)等酰胺类物质对猪精液冷冻保存效果，表明用50 mL/L的DMF代替甘油起到较好的效果；张树山等[2]研究证实DMF与甘油混合使用比单一使用效果更好。

在精液的冷冻过程中，精子冷冻和解冻的关键阶段是精子的初始冷却以及恢复到正常生理环境的时期，实际上精液冷冻保存过程基本上是一个冷冻干燥过程。在冷却过程中，精子脱水达到冰晶形成的温度时，精子外环境随着精子全部脱水而结晶化，而精子内未形成冰晶，因此可保护精子内物质。美国科学家Mazur[3]提出两因素理论来解释造成细胞或胚胎低温损伤的原因。溶液损伤是由于冷却速率过慢，大量水分在胞外的溶液中结冰，使得溶液浓度提高，造成胞内水分大量渗出，从而导致细胞强烈收缩，因为细胞长时间处于高浓度的溶液中，致使细胞损伤；胞内冰损伤是因为冷却速率过快，胞内水分不能及时通过细胞膜向外渗出，胞内溶液由于过冷而结冰，造成细胞机械损伤。稀释液中加入冷冻保护剂后，冷冻保护剂与水分子相结合，弱化了水的结晶过程，减少胞内冰晶的形成。另外，冷冻保护剂能够在精子内外维持一定浓度，降低未结冰溶液电解质的浓度，从而使精子免受损伤。

2 非渗透性冷冻保护剂的保护作用

非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，用于生产中的非渗透性冷冻保存剂以单糖、双糖较常见。非渗透性保护剂不能渗入到细胞内，在冷冻过程中能够提高细胞外渗透压，使细胞内的水分向细胞外渗出，引起细胞脱水、皱缩，减少胞内冰晶形成，从而保护细胞免受破坏[4]。现今常用的非渗透性保护剂主要有海藻糖、蔗糖、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚已二醇(PEG)以及白蛋白等。对于非渗透性冷冻保护剂的双糖、海藻糖引起了研究人员的高度关注。海藻糖是一种十分稳定的非还原性双糖，与蔗糖和麦芽糖等具有相似的分子结构和生理作用，是天然双糖中最稳定的糖类，对细胞无毒害作用。海藻糖具有独特的非特异性保护作用，可以保护细胞磷脂的双分子层，在冷冻过程中能够在细胞膜外产生一种玻璃状的保护层，提高细胞对胞外高渗溶液的耐受性，从而发挥保护细胞活性的作用[5]。Garcia等[6]研究表明，海藻糖作为一种水分子替代分子，在冷冻过程中可使细胞膜在固相-液相相互转变中免受损伤，在细胞内主要作为一种亲和性溶质来对抗细胞膜外的渗透压变化。海藻糖保护精子的机制与其晶体结构、溶液的物理构象和化学特性密切相关，冷冻时海藻糖可以强有力地束缚水分子，与膜脂质共同拥有结合水或者本身起到代替膜结合水的功能，具有稳定细胞膜和蛋白质结构的特性，防止细胞因失水而造成细胞结构和功能损伤。Jelinkova等[7]研究表明，海藻糖在动物精液冷冻保存中的作用类似于其他双糖，尤其是蔗糖，但一定要与渗透性冷冻保护剂结合使用才能更加有效地保护精子。Alex等[8]研究表明，通过向猪精液冷冻稀释液中添加海藻糖后，能够有效提高精子的活力、质膜完整性以及顶体完整率。近年来，科学家致力于非渗透性冷冻保护剂的研究，并结合向稀释液中添加其他成分以改善冻后精子质量。张婷等[9]研究证实，海带多糖可以提高冻后精子活率、顶体完整率、质膜完整率和DNA完整率，同时清除自由基、抑制脂质过氧化和提高抗氧化酶活性。张树山等[10]研究表明，稀释液中添加浓度为6 mg/L的红景天多糖较能明显提高猪冷冻精子品质，并能为猪精子提供较好的抗氧化作用。Hu[11]等研究发现，绞股蓝多糖对猪精液的冷冻保存具有一定保护作用。

3 其他保护剂对猪精子的保护作用

经多年研究，猪精液冷冻稀释液的基本成分已经确定，研究者们尝试在已有的稀释液中加入一些其他成分，用来改善精子外环境的理化性质，提高精子活力和受精能力。李青旺等[12]研究表明，猪冷冻稀释液中添加安钠咖后精子的冻后活力可提高到57%。曾维斌等[13]在猪冷冻稀释液中添加2 mg/mL咖啡因，冻后精子活力以及存活时间明显改善。张树山等[14]研究表明，大豆卵磷脂可以在猪精液冷冻保存中起到一定的抗冻保护作用。Hu等[15]研究表明，猪精液冷冻稀释液中添加9%(v/v)的低密度脂蛋白(LDL)，冻后精子活率和顶体完整率显著提高；Jiang等[16]研究表明，添加8%～9%的LDL能较好保护冻后猪精子的DNA完整性。李博玲等[17]报道单独添加0.25 mg/mL褪黑素、5 mmol/L谷胱甘肽以及联合添加0.125 mg/mL褪黑素和1 mmol/L谷胱甘肽，均能减少精液冷冻过程中活性氧的生成，显著提高冷冻精子解冻后的质量。杨宝卫等[18]研究表明，盐酸多巴胺能有效改善冻后猪精子的畸形率和顶体完整率。李美珍等[19]将中药提取物冷冻猪精液，表明盐酸川穹嗪均能显著降低冻后精子的畸形率，提高冻后精子的顶体完整率。研究还发现，生物类黄酮和多不饱和脂肪酸对猪精液冷冻保存具有一定保护作用。

4 存在的主要问题

猪精液中含有大量精清，精清中存在许多未被人类认知的蛋白质成分，对精子有一定的毒害作用[20]。在猪冷冻精液过程中通过离心去除精清，尚无法彻底消除精清对精子的影响。猪精子对低温打击非常敏感，在添加冷冻保护剂的情况下，如果能以5000 ℃/s的速度降温，使精子快速越过0～-60 ℃的危险温区，则可改善冰晶对精子的损伤。由于猪冷冻精液生产过程复杂，精子可能长时间暴露在有氧环境下使大量精子膜损伤，呼吸抑制，需要有效的抗氧化剂减少精子自身过氧化损伤。虽然对精子冻伤的研究已经发展到分子水平，但仍然需要结合各种研究手段探索提高精子冻后活力的方法。

目前，猪冷冻精液在人工授精生产中的应用量很少。猪冷冻精液细管的生产过程较为复杂，冷冻稀释液配方成分尚不确定，大剂量包装的猪冷冻精液尚在试验阶段，难以用于生产和应用。因此，猪冷冻精液难以达到人工授精的基本要求，从而严重制约了猪冷冻精液在猪育种及其商品化生产中的推广与应用。

5 猪冷冻精液应用前景

精液冷冻保存技术可以建立一个不受时间、地域限制的“精子库”，为大量母猪提供携带优秀基因的精子，加快品种培育遗传进展和改良速度，还为猪繁殖生产提供生物安全保障，避免种畜间的疾病传播，并使得原有90%～95%的种公猪可被淘汰，大大节省饲养成本。同时精液冷冻保存技术也为濒危品种遗传资源基因库的建立开辟了一条高效低成本的保存与利用途径。猪精液冷冻保存最主要的目的就是满足人工授精的需求。在当前冷冻保护剂应用的基础上，研究冷冻保护剂之间的配伍效应，寻找新型的冷冻保护剂代替或者部分代替对精子有毒害作用的保护剂是今后研究的趋势。目前对精液冷冻保护的研究主要工作仍停留在保护剂的开发和冷冻过程的完善，而分析保护剂对猪精液的毒害作用，精子中各种蛋白在冷冻前后表达差异，猪精液冻融后超微结构的变化，精子抗冻能力和冷冻对精子有关基因和人工授精的后代的影响研究较少，下一步研究应该探究冷冻在分子层面上对精子的损伤机理。

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