特殊染色及组织化学技术在病理诊断及科研中的应用

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(1 青岛大学医学院附属医院病理科,山东 青岛 266003； 2 青岛大学医学院附属医院药剂科;3 青岛大学医学院附属医院东区特检科； 4 山东大学齐鲁医院病理科)

特殊染色和组织化学染色技术是病理学研究常用的方法之一，也是临床病理诊断中重要的辅助技术之一。近20多年来，随着免疫组织化学及分子病理等技术的开展，在病理诊断过程中一些需要进行特异性标记的物质的染色，大部分已被免疫组化和分子病理学技术所替代完成，但仍有一些特殊物质标记是不能被这些新技术所替代(如细菌、色素、基底膜等)。特殊染色和组织化学技术具有特异、简单、快捷、廉价等显著优点，并且这些技术也在发展和完善，至今还没有出现更好的、完全替代它的直接显示细胞内外特殊化学物质的简便易行的方法和技术[1]。因此，特殊染色和组织化学技术应该引起我们的重视。

1 特殊染色和组织化学染色的概念和机制

特殊染色和组织化学染色常用于显示在苏木精-伊红(HE)染色中难以观察或观察不到的组织成分或组织细胞内所含的某些物质，以了解这些物质在组织和细胞中的分布、含量和变化，以研究组织细胞的生理和病理改变及机制。

1.1 特殊染色技术

特殊染色是一项复杂的染色过程，其染色机制目前尚不清楚。一般来说，被染色的物质通过直接与染料结合而呈色，只在特殊情况下才应用，因此习惯称为特殊染色，以示与常规HE染色的区别[2]。常用的特殊染色的染料有很多种，大致分为天然染料如苏木精、胭脂红、地衣红等，合成染料如亚硝基类(萘酚绿-B)、硝基染料(苦味酸、马休黄等)、偶氮染料(刚果红、丽春红、维多利亚绿、苏丹类等)、重氮盐类(坚牢红)、醌亚胺染料(中性红、甲苯胺蓝)、苯甲烷类(碱性品红、酸性品红、苯胺蓝、亮绿、甲基绿、结晶紫等)；也可按染色对象分为组织染色染料(结缔组织和肌纤维、神经组织等)、细胞染料(细胞核、细胞质及细胞化学成分如糖类、脂肪、核酸等)[3]。如Masson三色染色中的肌纤维被丽春红染成红色，胶原纤维被苯胺蓝染成蓝色；PTAH染色中磷钨酸苏木精将横纹肌等染成蓝色；刚果红染色将淀粉样物质染成红色，神经髓鞘被亮绿染成绿色等。

1.2 组织化学技术

又称经典组织化学技术，是将细胞学、组织学和生物化学结合起来的一门染色技术，其原理是应用某些试剂或染料与组织细胞内的化学成分进行特异性反应，或染料分子结构的某些基团与组织内的相应基团特异性结合，通过颜色的变化显示组织结构中的各种化学成分，并对这些化学物质进行定性、定位、定量，从而研究生物生理或病理状态下细胞组织的代谢、功能及形态变化规律[3]。如奥辛蓝过碘酸雪夫法(ABPAS)染色中Schiff试剂将糖原和中性黏液物质染成红色，而将酸性黏液物质染成蓝色，混合性黏液物质染成紫红色；用甲基绿-派洛宁法可显示RNA和DNA；亚铁氰化钾将含铁血黄素染成普鲁士蓝色；组织中各种酶如三磷酸腺苷酶、琥珀酸脱氢酶、葡萄糖6磷酸酶、乳酸脱氢酶等的染色。总之，凡是蛋白质、糖类、核酸、色素、某些金属、脂肪、酶类等染色都属于组织化学染色技术。

2 特殊染色和组织化学染色的特点

特殊染色和组织化学染色能对组织细胞中的某些特殊物质进行定性、定量和定位，而普通的生化检测只能定性和定量。如酶组织化学染色不仅可以检测出酶的性质，而且可以测定酶的含量(根据阳性反应的强弱)，确定酶的定位(如琥珀酸脱氢酶定位在线粒体中，酸性磷酸酶和碱性磷酸酶主要定位在溶酶体内，葡萄糖6磷酸酶定位于粗面内质网)等。应用Feulgen法显示DNA，应用甲基绿-派洛宁法显示DNARNA，并根据显示的部位、强弱及染色的深浅对其进行定位、定量、定性分析。应用Masson三色法既可以显示胶原纤维(阳性或阴性)及其含量的多少(颜色的深浅)，同时还可以观察到胶原纤维在心肌中的分布。

3 特殊染色和组织化学染色技术在临床及科研中的应用

特殊染色和组织化学染色技术在临床和科研上应用非常广泛。如HE染色不能明确地显示细菌，而需用特殊的染色：结晶紫-中性红法可区分组织中革兰阳性、阴性菌，苯酚碱性品红法可用于检查结核杆菌、麻风杆菌；慢性胃炎、消化性溃疡等疾病与幽门螺杆菌有密切关系，硝酸银、美蓝法可检出胃黏膜上皮处的幽门螺杆菌。切片内的真菌HE染色着色差，特别是真菌数量较少、菌体体积小时更难辨认，应用六胺银法能较好地显示各种真菌，特别是对曲菌、毛真菌、放线菌的显示效果较佳；各种真菌菌壁均含有多糖类物质，高碘酸-无色品红法可显示大多数真菌，是目前应用较为广泛的方法。新型隐球菌的荚膜由一种黏多糖组成，黏液胭脂红和爱先蓝染色呈阳性反应；淀粉样蛋白在HE染色中有时和玻璃样变难以区别，可用甲醇刚果红法区分。临床上长期肺淤血和出血、肝硬化时慢性脾淤血、陈旧性出血灶等病变中均有含铁血黄素，采用亚铁氰化钾法可将其与组织中出现的黄棕色的色素如疟色素、黑色素、甲醛色素等区分。应用AB-PAS可区分中性黏液和酸性黏液，从而判断是肠型胃癌还是胃型胃癌。皮肤的色素性荨麻疹和系统性肥大细胞增生症的病理诊断需要根据特异性的肥大细胞染色显示才能确诊；在同一组织中同时出现分化程度较低的癌和肉瘤细胞时，可用Gordon-Sweets法加以鉴别，此法要比免疫组化方法简单实用的多。一些特殊的神经组织如神经纤维、神经髓鞘、尼氏小体等都可用特殊染色清楚地显示出来。

4 特殊染色和组织化学染色的技术要求

特殊染色技术与常规的制片技术有许多相同之处，但在操作程序上较常规制片要严谨的多；而组织化学技术则根据标本中所含物质的不同，要求条件更加严格。这需要医生和技术员的密切配合。

4.1 对标本取材的要求

用于特殊染色和组织化学染色的材料有冷冻切片、石蜡切片、细胞涂片等。取材时的标本越新鲜越好，以保持生物体的原状；取材时应尽量避免组织变形、挤压、破碎；光镜标本大小不超过1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm。需要酶组织化学染色的标本因需保留组织中酶的活性，因此要用冷冻切片，最好在低温下(-20 ℃～-18 ℃左右)操作，切好的片子可于-20 ℃或-80 ℃保存。

4.2 对标本固定的要求

特殊染色和组织化学染色时，应尽量保留组织细胞内的化学成分和酶的活性，防止细胞内物质的弥散、移位、溶解、丢失。取材后的标本最好是在离体后10～30 min内立即用相应的固定液固定。但是，组织中的化学物质和酶的种类繁多，其理化性质及特点各不相同，因此应根据被检物质的不同选择不同的固定液及固定方法。最常用的固定方法是组织浸泡法，一般固定液的量不少于组织块的5倍。固定液的种类有很多种，但至今没有一种固定液适用于所有的组织染色法。大部分特殊染色和组织化学染色需要的固定液为40 g/L中性缓冲甲醛或40 g/L中性甲醛，40 g/L的甲醛也可用作固定液，但甲醛易被氧化成甲酸，使固定液偏酸性，破坏组织中的某些物质,而影响其他染色。中性缓冲甲醛或中性甲醛的配制方法： 0.1 mol/L磷酸缓冲液90 mL+40 g/L甲醛10 mL或40 g/L甲醛液中加入碳酸钙至饱和。也有少部分用于特殊染色和组织化学染色的组织或细胞需要用特殊的固定液，以使细胞内的化学物质在组织固定过程中不能溶解，且定位准确。如PTAH染色常用Zenker固定液固定标本，对于已用甲醛固定的切片，则在染色前用Zenker固定液重新固定；Masson染色显示胶原纤维和肌纤维则最好用Bouin液固定标本。糖原染色时组织绝对不能用甲醛固定液固定，因为甲醛液可使糖原与蛋白质结合而不溶于水，这过程中糖原并不与蛋白质发生化学结合，而是机械地包含在凝结的蛋白质内，使细胞内的糖原(特别是不稳定性糖原)损失。所以糖原染色应用含乙醇溶液的固定液固定标本，常用的固定液为Carnoy液，但应注意的是Carnoy固定液虽然能较好地固定糖原，但易出现“极化现象”，即糖原在固定中可流动到细胞一侧，观察时应注意。而脂肪染色时不能采用含乙醇的固定液，也不能作石蜡切片，而需用冷冻切片经40 g/L甲醛固定后直接染色。酶组织化学染色的组织不需要固定，取材后的标本应即刻冷冻切片，或-80 ℃冷冻保存，需切片时再孵温至切片温度。

4.3 对染色试剂和染色条件的要求

特殊染色和组织化学染色需要有较高的特异性，尤其是组织化学染色，每种染色都需要有专一的染料、试剂或底物；染色时还需要控制一定的时间及pH环境,如Fe3+应用专一的亚铁氰化钾和盐酸处理后，可产生蓝色，故又称普鲁士蓝反应；DNA染色可用Schiff液和盐酸，而同时显示DNA和RNA则需要用派洛宁和甲基绿；显示三磷酸腺苷酶所用的底物是三磷酸腺苷，但根据不同的pH又可显示3种不同的肌肉类型。染色时所用的器皿必须经酸清洁液处理，以确保染色器皿清洁无污染；染色所用试剂必须是分析纯(A.R)，而且对被检测物质或酶无任何影响，所用蒸馏水最好是双蒸水或去离子水；缓冲液的pH值要准确，配制试剂时所用器皿要专一，不能混用，配制结束后所用器皿经酸清洁液处理后，再用自来水和蒸馏水反复冲洗干净后烤干备用。染色过程中大部分染色方法采用滴染法，这样可以节省染液；但有些方法却必须浸染，如磷钨酸苏木精法，因染色时间较长(24～48 h)，就必须用染色缸来浸染；有些染色液用乙醇配制如醛品红、地衣红等，染色时液体易挥发，也不宜滴染；无色品红染液在染色时需要避光，也不宜滴染。有些染色试剂配制后有使用有效期，应在试剂瓶上标明配制时间。有些试剂易起氧化还原反应，应密闭放入4 ℃冰箱保存。

5 特殊染色和组织化学染色技术的操作规范及实验对照

大部分特殊染色和组织化学染色过程复杂，影响染色结果的因素很多，染色过程中技术操作是否规范很重要。结缔组织中的三大纤维、细菌和病毒、色素和病理性沉着物、内分泌细胞颗粒、脂质、糖类、核酸及各种酶的染色中，每种物质的显示都有一种或多种相应的染色方法，并需要配制相应的染料和试剂，进行不同的染色步骤，因此在染色操作过程中严格控制反应物质的浓度、反应时的温度、试剂的pH值、反应时间尤为重要。六胺银、PAS染色等均为进行性染色，需要严格的镜下控制；而DNA和RNA染色、酶组织化学染色等则需要病理技术人员要有过硬的技术水平。染色过程中为了保证实验的可靠性、科学性，防止假阳性结果的出现，应采用已知含有所显示物质的标本作阳性对照，用已知不含有所显示物质的标本或用抑制和消化等方法进行阴性对照。总之，熟练的技术可直接影响制片的质量，而作为病理技术员要学会观察每一张切片，以确保染色的正确性。

6 免疫组化技术不能完全取代特殊染色及组织化学染色

特殊染色及组织化学染色从19世纪中叶Virchow细胞病理学时代开始，一个多世纪以来虽然发展了上百种染色方法，但其发展速度非常缓慢，这是由于组织成分各自具有独特的、互不相同的检测方法，一种酶需要一种底物,难以掌握全面，对病理技术员技术要求很高，其应用受到限制。免疫组化是组织化学的一种特殊类型，是用免疫学的方法，把抗体标记上可见的颜色，如荧光素、酶、某种金属等呈色物质，使抗体由不可见变为可见，以检测组织细胞中的抗原，即用颜色的变化来判断组织细胞中的化学成分[4]。虽然越来越多的特殊染色和组织化学染色被取代，但还是有相当一部分特异性物质染色是免疫组化所取代不了的。原因：①免疫组化在蛋白质水平上对细胞染色相对特异，而许多结缔组织或细胞内的蛋白质是以络合物形式存在，特殊染色对复合蛋白质的显示有着特殊显示效果。如在同一张切片上可以不同色调显示不同的成分，因而可一目了然地从整体结构上显示出各种不同的组织成分，如心血管疾病组织中肌纤维的胶原化、钙盐的沉积、弹力纤维的变性和断裂、纤维组织的黏液变等，应用一个简单的Masson三色染色就可在短期内完全诊断；某些色素分类通过特殊染色便可直观显示。②组织化学染色除可特异性地显示某些蛋白质以外，还可以相对显示核酸的分布特点。如Feulgen染色后，通过图像分析仪或流式细胞仪可检测DNA倍体，从而反映出机体的功能状态。又如在显示细胞内特殊酶类时，以酶促反应的形式可相对特异地显示这些酶的存在或分布，而免疫组化特异性抗体不能完全显示这些酶。因此，在进行临床诊断和科研工作时不能忽视特殊染色和组织化学染色技术。

[1] 王德田，董建强. 实用现代病理学技术[M]. 北京：中国协和医科大学出版社， 2012：86.

[2] 梁英杰，凌启波，张威. 临床病理学技术[M]. 北京：人民卫生出版社， 2011：87.

[3] 王伯沄，李玉松，黄高昇，等. 病理学技术[M]. 北京：人民卫生出版社， 2001:106-110,202.

[4] 吴秉铨，刘彦仿. 免疫组织化学病理诊断[M]. 北京：北京科学技术出版社， 2007：3-4.