分光光度法测定甘氨酸亚铁产品中游离甘氨酸的含量

■ 郭晓明 高安翔 陆圣杰 许甲平冯一凡 吴亚斌

（1.上海应用技术学院化学与环境工程学院，上海 201418;2.上海德邦牧业有限公司，上海 201108）

甘氨酸亚铁具有稳定性好、吸收率高、无胃肠刺激及生物学效价高的特点，是新一代的补铁添加剂[1]。在饲料中添加甘氨酸亚铁为防治动物贫血症和增强动物免疫力提供了一条高效、安全、简便的途径。

甘氨酸亚铁产品中游离甘氨酸（未螯合的甘氨酸）的含量反映生产过程中甘氨酸与亚铁离子的螯合率，在一定的前提条件下也能反映甘氨酸亚铁的稳定性，是评价生产工艺和产品性能的一项重要指标，当前主要采用非水滴定法测定[2]。

本文采用分光光度法来测定甘氨酸亚铁产品中游离甘氨酸的含量。考察了显色剂浓度、还原剂浓度、显色反应时间及温度等参数对吸光度的影响，确定了最佳显色条件，绘制了工作曲线并应用于实际样品的测试，获得了较好的测定结果。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

双光束紫外可见分光光度计（TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司）、循环水式真空泵（河南巩义予华仪器厂）、恒温水浴槽（HHS-21，上海博迅医疗设备有限公司）、电子天平（BS224S，北京赛多利斯仪器系统有限公司）、微量移液器（大龙兴创实验仪器有限公司）。

甘氨酸、茚三酮、抗坏血酸、乙醇、乙二醇甲醚、冰醋酸、无水醋酸钠均为分析纯（国药集团化学试剂公司），甘氨酸亚铁由作者实验室自行制备。茚三酮用乙二醇甲醚溶解，配制成3%(wt.%)的溶液，抗坏血酸用去离子水溶解，配制成0.3%(wt.%)的溶液，现配现用。

1.2 实验方法

1.2.1 显色反应条件的确定

称取30 mg甘氨酸，加入到50 ml冰醋酸中，搅拌溶解，转移到100 ml的容量瓶中，用1 mol/l的醋酸钠定容。从中移取10 ml再用1 mol/l醋酸钠溶液定容至100 ml。移取5.0 ml该溶液到25 ml的容量瓶中，加入抗坏血酸和茚三酮，将容量瓶置于一定温度下的水浴槽中，水浴反应一定时间。取出，迅速冷却至室温，用50%乙醇溶液定容至25 ml。用分光光度计在570 nm处测量溶液的吸光度，以试剂空白为参比。改变水浴温度、水浴时间、茚三酮和抗坏血酸浓度，考察这些参数对吸光度的影响，选择最佳的显色反应条件。

1.2.2 工作曲线绘制

取30 mg甘氨酸溶解于冰醋酸中，并用冰醋酸定容至50 ml。取该溶液15 ml，用冰醋酸稀释到50 ml，用1 mol/l醋酸钠定容到100 ml。移取0.2～1.0 ml该溶液加入到25 ml的容量瓶中，在已确定的最佳显色条件下显色并测定其吸光度，绘制工作曲线。

1.2.3 甘氨酸亚铁产品中游离甘氨酸的测定

称取2.5 g甘氨酸亚铁样品加入至30 ml冰醋酸中，搅拌10 min，再浸渍10 min，减压过滤，用20 ml冰醋酸分多次洗涤滤瓶。将滤液转移到100 ml的容量瓶中，用1 mol/l的醋酸钠定容。取1 ml该溶液加入到25 ml的容量瓶中在最佳显色条件下显色，测定其吸光度。

2 结果与讨论

2.1 显色条件的选择

2.1.1 最大吸收波长的确定

茚三酮与甘氨酸显色后溶液呈现紫色，其可见吸收光谱如图1所示。最大吸收波长在570 nm处，410 nm处虽也有强吸收峰，但因该吸收波长选择性不高，故不予以采用[3]。

图1 可见吸收光谱曲线

2.1.2 反应温度的选择

按1.2.1所述步骤，加入显色剂茚三酮的浓度为0.6%(wt.%)，还原剂抗坏血酸的浓度为0.036%(wt.%)，分别将容量瓶置于30、50、60、75、90 ℃恒温水浴槽中加热10 min。考察显色反应温度对吸光度的影响，结果如图2所示。由图2可见，随着反应温度的升高，反应溶液的吸光度也逐渐增大，在75℃达到最大。因此，选择75℃为最佳显色反应温度。

图2 反应温度对吸光度的影响

2.1.3 反应时间的选择

按1.2.1所述步骤，加入显色剂茚三酮的浓度为0.6%(wt.%)，还原剂抗坏血酸的浓度为0.036%(wt.%)，分别将容量瓶置于75℃的恒温水浴槽中加热5、8、10、12、15 min。考察显色反应时间对吸光度的影响，结果如图3所示。由图3可见，随着水浴加热时间的延长，反应溶液的吸光度也逐渐增大，10 min达到最大后又开始下降。反应达15 min时，溶液的最大吸收波长发生蓝移，从570 nm变为567 nm（如图4）。故最佳水浴时间确定为10 min。

图3 反应时间对吸光度的影响

2.1.4 茚三酮用量的选择

固定抗坏血酸的浓度为0.036%(wt.%)，显色反应温度为75℃，反应时间为10 min。考察显色剂茚三酮浓度对吸光度的影响。由图5可见，随着茚三酮浓度的增加，溶液的吸光度也逐渐增加，浓度达到0.6%(wt.%)后上升趋势变缓。因此，茚三酮的浓度确定为0.6%。

图4 反应15 min的吸收光谱曲线

图5 茚三酮用量对吸光度的影响

2.1.5 抗坏血酸用量的选择

茚三酮与α-氨基酸的显色反应有较多的副反应。为了得到紫色的主反应产物，需要加入一些还原剂抑制副反应的发生。通常的还原剂有氰化钠、氯化亚锡和三氯化钛等，这些还原剂有一定的毒性或会对环境有不良影响。文献[3]采用抗坏血酸作还原剂获得了较好的显色效果，因此本文也用抗坏血酸做还原剂。

固定茚三酮的浓度为0.6%(wt.%)，显色反应温度为75℃，反应时间为10 min。考察抗坏血酸浓度对吸光度的影响。由图6可见，随着抗坏血酸浓度的增加，溶液的吸光度也逐渐增大，浓度到达0.036%(wt.%)后吸光度变化很小。故抗坏血酸的最佳浓度选定为0.036%。

2.2 标准曲线

配制一系列不同浓度的甘氨酸溶液，在已确定的最佳实验条件下测定其吸光度，获得的工作曲线如图7所示。吸光度与甘氨酸的浓度在0.75～3.75 μg/g呈线性关系，线性方程为A=0.148+0.071 7c（μg/g），相关系数R=0.994 2。

图6 抗坏血酸用量对吸光度的影响

图7 工作曲线

2.3 样品的分析

2.3.1 游离甘氨酸与甘氨酸亚铁的分离

茚三酮不但能与游离的甘氨酸发生反应，而且可以和甘氨酸亚铁中的甘氨酸反应并促使甘氨酸亚铁分解。因此，采用茚三酮作显色剂测定甘氨酸亚铁产品中的游离甘氨酸必须先把甘氨酸分离出来。从氨基酸螯合物产品中分离出游离氨基酸通常有凝胶过滤色谱法[4]和离子交换法[5]，然而这些方法操作繁琐，实验条件控制要求高。本文利用甘氨酸和甘氨酸亚铁在冰醋酸中溶解度的差异来实现两者的分离。

作者测定了25℃时甘氨酸和甘氨酸亚铁在醋酸中的溶解度。结果显示，甘氨酸的溶解度为440 mg/100 ml醋酸，而甘氨酸亚铁的溶解度小于2 mg/100 ml醋酸。由于两者的溶解度差异很大，可以通过溶解过滤的简单办法实现两者的分离，具体过程参阅文献[6]。

2.3.2 样品的测试结果

按1.2.3所述步骤测定甘氨酸亚铁产品中的游离甘氨酸含量，同时做加标回收实验，测定结果如表1所示。同一样品6次测定的RSD为2.32%，表明方法的精密度较好。在样品中加入0.5、1.0和2.0 mg/g的分析纯甘氨酸，回收率为95.4%～106.9%，表明该方法的准确度也较好。因此，该方法可以用于甘氨酸亚铁产品中游离甘氨酸的测定。

3 小结

采用茚三酮分光光度法对甘氨酸亚铁产品中游离甘氨酸含量进行了测定。最佳显色条件为：茚三酮的浓度为0.6%，抗坏血酸浓度为0.036%，显色反应温度为75℃，显色反应时间为10 min。在最佳条件下，工作曲线的线性范围为0.75～3.75 μg/g，相关系数R=0.994 2。实际样品测定结果的RSD为2.32%，加标回收实验的回收率为95.4%～106.9%。该方法具有较高精密度和准确度，能够满足实际样品分析检测的要求。