急性冠脉综合征生化标记物研究中的蛋白质组学应用

董剩勇 综述 曾 强 审校

解放军总医院 国际医学中心，北京 100853

传统的心血管危险因素，如吸烟、血脂异常、高血压、糖尿病等，并不能准确预测心血管恶性事件。近些年来，生化标记物的研究成为急性心肌缺血诊断和预后评估研究中的热点[1]。新的生化标记物不断涌现，如心肌肌钙蛋白T或I(cTnT或cTnI)、C-反应蛋白、氨基末端脑钠肽原(N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP)、非结合游离脂肪酸、缺血修饰白蛋白、髓过氧化酶、妊娠相关血浆蛋白A、可溶性CD40配体、脂蛋白相关磷脂酶A2和生长分化因子15等，并逐步用于急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)的早期诊断和预后评估[1]。不断改善的检测手段也极大地提高了现有标记物的诊断灵敏度和特异度以及标记物预测心血管恶性事件的能力[2]。然而，由于ACS动脉粥样硬化斑块的异质性和复杂性，现有生化标记物(包括cTnT和cTnI在内)并不能全面地反映ACS疾病进展及预后状态[3]。因此，从海量的蛋白质组中寻找新的、能补充反映心肌损伤程度或发病时间的、在诊断和危险分层上有高敏感度和特异度的生化标记物仍然是非常有必要的[4]。蛋白质组学技术的迅速发展正好满足了这一需求。蛋白质组学技术正逐步由传统的二维电泳(2-dimensional electrophoresis，2DE)技术向高通量和高灵敏度的质谱分析(mass spectrometry，MS)技术过渡。目前，蛋白质组学技术被广泛应用于肿瘤生化标记物的检测[5]，其在ACS生化标记物研究中的应用报道较少[3-6]。本文将从血液蛋白质组学、动脉粥样硬化组织蛋白质组学以及心肌组织蛋白质组学3个方面就蛋白质组学技术在ACS生化标记物研究中的应用作一综述。

1 血液蛋白质组学

1.1 血浆 血浆中大约有900 000种蛋白。从临床角度来看，ACS患者血浆标本的蛋白质组学检测最有可能提供诊断和预后评估信息。目前观念认为，利用MS技术检测胸痛患者的血浆标本可得到质谱峰值群(蛋白谱)，通过对不同蛋白谱的直接比较可以快速地筛选出ACS患者，从而节省了蛋白峰值鉴定所需要的时间而实现ACS的早期诊断。并且，这种蛋白谱包括了多种蛋白质，往往比现有的单一生化标记物有着更出色的诊断和预后评估敏感性[7]。我们课题组既往运用表面增强激光解吸附-时间飞行(surfaceenhanced laser desorption/ionization time-of-flight，SELDITOF)质谱技术对500名ACS患者的血浆样本进行蛋白质组学分析，得到1 921.09、2 124.2和20 887.3质核比(m/z)的蛋白峰值群，其在ACS患者早期危险分层上的曲线下面积(AUC=0.93，P＜0.001)明显高于传统的生化标记物NT-proBNP(AUC=0.63，P＜0.001)和cTnT(AUC=0.74，P＜0.001)[8]。我们课题组随后发现利用SELDI-TOF MS技术得到的新标记物4 174.39 m/z预测ACS患者长期主要不良心血管事件的能力(AUC=0.73，P＜0.001)也 优 于cTnT(AUC=0.45，P=306)和肌酸激酶同工酶-MB(AUC=0.51，P=870)[9]。

利用蛋白质组学技术检测ACS患者血浆，发现新的生化标记物用以阐述ACS不同致病机制或指导ACS治疗[10]。例如，Kopetz等[11]采用2DE和液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)技术对9名存在冠脉慢流现象的ACS患者血浆进行蛋白质组学分析，发现在胸痛发作时抗氧化酶对氧磷脂酶-1、抗胰凝乳蛋白酶α-1和抗胰蛋白酶α-1表达水平明显增加，从而认为炎症/氧化压力是这部分患者再发ACS的重要致病机制。Distelmaier等[12]首次利用质谱串联技术(MS/MS)对急性心肌梗死(alternate mark inversion，AMI)患者斑块破裂处的血浆进行蛋白质组学分析，并与股动脉鞘处的血浆蛋白质组学检测结果比对，发现斑块破裂处血浆中基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)高表达和色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)低表达，从而认为当中性粒细胞释放MMP-9增多时，后者降解了从血浆弥散到斑块细胞外基质中的PEDF，导致内皮细胞抗氧化能力减弱，斑块内组织氧化压力增强，最终导致斑块破裂。Eberini等[13]利 用2DE和LC-MS/MS技 术 检 测AMI患者血浆，发现AMI患者溶栓治疗后载脂蛋白A-1存在着显著的降解，引起血液高密度脂蛋白的运载能力降低，进而血管保护能力降低，最终导致溶栓后再行冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)者预后更差。

还有学者利用蛋白质组学技术检测ACS患者血浆中现有生化标记物的不同亚型或修饰形式，为生化标记物抗体效能的评估或ACS不同疾病状态的特异性诊断提供更多的信息。Bates等[14]和Guy等[15]利用多种cTnT单克隆抗体和cTnI单克隆抗体结合MS技术发现cTn在AMI患者中存在着游离、复合体、水解片段、共价交联以及磷酸化等多种修饰形式。这些修饰形式的存在不仅影响着不同抗体的检测效能，也可能反映了AMI患者的心肌损伤程度以及不同预后情况[16]。Fujimoto等[17]利用磁珠抗体结合基质辅助激光解吸电离-时间飞行(matrix-assisted laser desorption/ionization TOF，MALDI-TOF)质谱技术对105例接受PCI手术的缺血性心脏病患者血浆样本进行蛋白质组学分析，发现含有32个氨基酸的脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)在血浆中存在着BNP(3-32)、BNP(4-32)和BNP(5-32)三种片段形式和BNP(1-32)的完整形式，在随访6个月后冠脉再狭窄的患者血浆中BNP(5-32)/BNP(3-32)的比例明显低于冠脉未狭窄的患者，而利用常规ELASA法检测到的血浆BNP水平在再狭窄患者和未狭窄患者之间没有差异；当BNP(5-32)/BNP(3-32)比值达到1.52时，排除缺血性心脏病患者冠脉再狭窄的灵敏度为100%。可见，蛋白质组学技术检测ACS血浆中现有生化标记物的不同修饰形式比单纯的ELASA方法更准确、更有意义。

1.2 血液循环单核细胞 单核细胞在动脉粥样硬化形成过程中具有重要作用。有研究报道，对ACS患者血液中的单核细胞采用蛋白质组学技术进行分析，以期获得新的ACS生化标记物[18]。Barderas等[19]利用2DE/MS方法检测非ST段抬高性ACS(non-ST-segment elevation ACS，NSTEACS)患者血液中的循环单核细胞，发现17种蛋白与稳定性心绞痛患者相比存在着差异； 并且，随着NSTEACS患者病情的好转，存在差异的蛋白数量逐渐减少，提示单核细胞中这17种蛋白可能与NSTEACS的发病密切相关。在这17种蛋白中，NSTEACS发作时抗动脉粥样硬化蛋白对氧磷酶1和热休克蛋白(heat shock protein，HSP)70以及抗炎症蛋白蛋白质二硫键异构酶低表达，而致动脉粥样硬化的组织蛋白酶D和促进巨噬细胞转变为泡沫细胞的烯醇化酶1高表达，也提示了这些蛋白具有成为潜在的ACS新生化标记物的可能[19-20]。

1.3 血小板 血小板活化在ACS病理进展中扮演着基础的角色。因为血小板没有细胞核，所以非常适合于蛋白质组学分析。Parguina等[21-22]首次利用2DE/MALDI-TOF MS技术分别于2010年和2011年对NSTEACS患者和ST段抬高性心肌梗死(ST-segment elevation MI，STEMI)患者血液中血小板进行蛋白质组学分析，发现与稳定型缺血性心肌病患者相比，NSTEACS和STEMI患者血小板中分别有40个和56个蛋白位点存在着差异，其中数个蛋白涉及到整合素和糖蛋白Ⅵ信号传导通路，并且随着ACS发病后时间的延长，存在差异的蛋白数量逐渐减少，提示这些信号通路可能与ACS患者血小板活化密切相关。随后，Ló pez-Farr é等[23]也利用2DE/MALDI-TOF MS技术发现ACS患者血小板中细胞骨架相关蛋白、糖酵解途径蛋白和细胞相关抗氧化系统表达降低。利用蛋白质组学技术检测这些差异蛋白可为血小板相关的ACS生化标记物的发现提供新的途径[24]。

1.4 内皮祖细胞 内皮祖细胞在维持内皮细胞稳态和完整性上起到了重要作用，且外周血液中循环内皮祖细胞数量与心血管恶性事件呈负相关[25]。Pula等[26]利用MALDI-TOF MS结合LC方法对循环内皮祖细胞进行蛋白质组学分析，发现内皮祖细胞通过旁分泌胸苷磷酸化酶而起到促血管生成作用。Mourino-Alvarez等[27]进一步利用蛋白质组学技术检测ACS患者血液中循环内皮祖细胞，发现内皮祖细胞高水平表达DNA修复和mRNA剪接相关蛋白，并且ACS患者内皮祖细胞中血液凝固相关蛋白和5HT4型、5HT3型等受体介导的信号通路与健康对照组相比存在差异。这些研究不仅进一步揭示了内皮祖细胞的生物特征，也提示了利用蛋白质组学技术发现内皮祖细胞源性ACS生化标记物的潜在价值。

2 动脉粥样硬化组织蛋白质组学

目前ACS血液蛋白质组学的难处在于从粥样斑块释放至血液中的蛋白质含量非常少，蛋白质组学技术难以完全将这些血液中低含量的蛋白质从高含量的蛋白质(如血清白蛋白)中检测出来[3]。此外，血液中循环细胞的分离和蛋白的提取是一个费时的过程，其中内皮祖细胞的分离还缺乏流式细胞技术金标准的支持[27]。基于以上原因，有学者转而利用蛋白质组学技术检测动脉粥样斑块组织或组织分泌蛋白，并认为在斑块组织中检测出来的新蛋白很有可能会分泌至血液中，进而被常规方法检测而成为潜在的ACS生化标记物[6]。

2.1 全组织 Bagnato等[28]首次报道了利用蛋白质组学技术直接检测动脉粥样斑块全组织。该学者首先应用激光捕获显微切割技术获取人冠脉斑块组织后，再利用LC-MS/MS技术直接对斑块组织进行蛋白质组学分析，发现了806个冠脉粥样硬化相关蛋白，其中PEDF、骨膜蛋白和膜链蛋白1被免疫组化方法所证实，并有可能成为ACS诊断的新生化标记物。随后，De Kleijn等[29]利用LC-MS技术分析动脉粥样斑块组织，发现了一个潜在的生化标记物—骨桥素，其与3年心血管事件密切相关。Lepedda等[30]也利用2DE/MALDI-TOF MS技术分析了不稳定粥样斑块组织和稳定粥样斑块组织的蛋白质组学特征，发现前者HSP27和膜联蛋白A10水平低于后者，而纤维蛋白原片段D水平则高于后者，研究认为这些差异蛋白与ACS心肌缺血事件中的斑块稳定性有关。以上研究也进一步提示对粥样斑块组织直接进行蛋白质组学检测的方法有助于发现更多有ACS诊断和预后评估价值的新生化标记物。

2.2 内膜组织 考虑到脂质核、纤维帽等动脉粥样斑块组织不同层的异质性会导致全组织蛋白质组学分析结果复杂，有研究转而分析特异性更高的粥样硬化冠脉内膜层[31]。因为动脉粥样硬化病变起始于内膜层，所以内膜层的蛋白质组学分析将有可能为那些无先驱症状的ACS患者提供新的早期诊断生化标记物。De la Cuesta等[31]从接受冠脉旁路移植术或心脏移植术的患者中获取粥样硬化冠脉、粥样硬化旁冠脉以及桡动脉组织，然后利用激光显微切割技术分离出内膜组织后再利用2DE和MALDI-TOF MS技术进行蛋白质组学分析，结果发现与粥样硬化旁冠脉和桡动脉内膜相比，粥样硬化冠脉内膜有13个蛋白存在着差异，其中膜联蛋白4、肌球蛋白调节轻链2和铁蛋白轻链为新发现的粥样硬化冠脉内膜蛋白质，其也有可能成为新的潜在ACS斑块组织早期生化标记物。

2.3 组织分泌蛋白 由于动脉粥样硬化组织包含了许多结构蛋白，利用蛋白质组学技术直接分析粥样斑块全组织或内膜组织时这些结构蛋白可能会掩盖某些选择性表达、低水平的潜在生化标记物。动脉粥样硬化组织蛋白质组学研究的另一策略就是对动脉粥样斑块组织进行培养，然后利用蛋白质组学技术分析组织分泌蛋白，从而可避免结构蛋白的干扰[3,32]。Martin-Ventura等[33]利用2DE和MALDI-TOF MS技术以及LC-MS/MS技术对动脉粥样斑块组织培养液和正常动脉组织培养液进行蛋白质组学分析，发现在动脉粥样斑块组织培养液中HSP27表达量明显降低，进一步研究发现动脉粥样硬化患者血浆中HSP27水平也明显低于健康对照组。该报道认为，HSP27与平滑肌细胞的移动和斑块稳定性有关，其很有希望成为预测动脉粥样硬化及ACS斑块恶化的潜在生化标记物。Blanco-Colio等[34]利用SELDITOF MS技术对动脉粥样斑块组织培养液中的上清液进行蛋白质组学分析，发现可溶性肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导因子(sTweak)低表达，随后也进一步在动脉粥样硬化患者血浆中检测到低表达的sTweak，提示sTweak可能为ACS潜在的生化标记物。Cooksley-Decasper等[35]利用类似的斑块组织培养方法和蛋白质组学技术分析动脉粥样斑块组织分泌蛋白，发现结合斑珠蛋白也可能为ACS潜在的生化标记物。

3 心肌组织蛋白质组学

ACS最主要的病理过程是引起心肌缺血、损伤甚至坏死。针对心肌组织的蛋白质组学检测能够得到心肌损伤不同程度、不同部位、不同时间下的蛋白谱差异，从而为ACS的特异性诊断、差异化治疗以及预后评估提供临床指导策略[36]。然而，不管在临床实践还是在基础实验中，获取人心肌组织的难度极大，以至于目前关于心肌组织蛋白质组学的研究报道极少。Chen等[37]利用2DE和LC-MS/MS技术检测鼠缺血心肌蛋白，发现线粒体乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)有4种磷酸化的形式，磷酸化的ALDH2为激活态，能保护心肌和减少心肌的缺血损伤；当对ACS患者给予长期的硝酸甘油治疗时，ALDH2将去磷酸化并失活，从而增加心肌缺血性损伤；而在约40%的东亚人群中，ALDH2处于非激活突变状态(487位的谷氨酸被赖氨酸代替)，此时对存在ALDH2突变的ACS患者给予持续的硝酸甘油将加剧心肌缺血，如果利用药物增加ALDH2的活性将可能为这类患者带来好处，提示ALDH2具有潜在的可能成为指导ACS治疗策略的生化标记物。Barallobre-Barreiro等[38]构建猪心肌缺血/再灌注损伤模型后，利用LC-MS/MS技术首次对心肌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)进行蛋白质组学分析，发现尽管损伤的左心室心肌与相邻部位的心肌ECM基因表达相似，但损伤的心肌ECM中促进心肌重构的蛋白(如软骨间质蛋白1、软骨基质蛋白4、细胞外脂肪细胞增加剂结合蛋白1等)表达水平明显增高，这些新的心肌ECM蛋白随后在人左心室心肌组织中得到证实；并且，蛋白质组学分析进一步发现在心肌缺血后心肌重构的早期和晚期阶段，转化生长因子β1均位于ECM重构网络结构的中心，研究提示心肌缺血/再灌注损伤后早期检测ECM重构、了解早期和晚期心肌组织纤维化特征，可为ACS的个性化治疗提供依据； 同时也提示通过蛋白质组学技术检测ECM蛋白可得到具有临床意义的ACS预后评估生化标记物和药物治疗靶点。

4 展望

由于ACS是多因素导致的有复杂病理生理过程的急性、高危性疾病，不太可能有单一的生化标记物能够高特异性和高灵敏度地诊断ACS。从血液、动脉粥样硬化组织以及心肌组织蛋白质组学所获得的新生化标记物有希望利用多标记物方法帮助阐述ACS致病的分子机制，改变目前ACS的临床诊断方式，发现新的能作为干涉治疗靶点并使ACS的治疗和预后评估更为接近个体化[3]。最后，从标本来源和临床实践来看，血浆蛋白质组学可能是ACS生化标记物研究中最合适、最快速的途径，也是最有可能将蛋白质组学成果转化为临床应用的途径。总之，高通量的蛋白质组学技术已经逐步用于ACS生化标记物的研究，其直接应用于临床仍然是很有希望的。今后ACS生化标记物的蛋白质组学研究应重点关注ACS粥样斑块形成和斑块破裂的分子机制，以及蛋白质及其功能相关的修饰在细胞通路中的研究，以便产生新的假设以促进临床上ACS新的诊断、治疗和(或)预后评估生化标记物。

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