虾夷马粪海胆CYP17 基因的克隆及其表达差异

郭晓黎，仇雪梅，常亚青，张伟杰，崔军，丛玉婷，吴领知，刘洋，王秀利

(1.大连海洋大学 农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连116023;2.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连116023)

海胆的可食用部分为生殖腺，其生殖腺有着生殖和储存营养的双重作用［1］。海胆的生殖腺含有大量蛋白质、氨基酸、高度不饱和脂肪酸、糖类等具有特殊生理活性的物质，特别是含有防治心血管疾病的有效药物成分，具有较高的营养和药用价值［2］。虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius原产于日本北海道和俄罗斯远东沿海，由于其生殖腺色泽好、味甜，在国际市场广受欢迎。大连海洋大学于1989年将虾夷马粪海胆从日本引入中国，目前已成为中国北方沿海特别是辽东和山东半岛养殖的重要海珍品［3］。

CYP17是细胞色素P450 家族的重要成员之一。CYP17 基因编码的细胞色素P45017α 羟化酶/17，20 裂解酶(17α - hydroxylase/17，20 - lyase)是类固醇激素合成的关键酶之一，该基因的表达水平可在一定程度上决定动物体内性激素的水平［4］。CYP17是合成雄激素的关键类固醇激素生成酶，同时对雌激素合成也是必不可少的(由雄激素芳香化而来)，在生殖内分泌中发挥重要作用［4-6］。CYP17 具有两种酶活性，即17α-羟化酶和17，20-裂解酶活性，前者可以催化孕酮或黄体酮转化成17α-羟基孕酮，后者继续催化17α -羟基孕酮转化成雄烯二酮。雄烯二酮再经过17β -HSD(17β-羟类固醇激素脱氢酶)生成睾酮，然后再在P450 芳香化酶(CYP19)作用下转化为17β - 雌二醇。而雌二醇是类固醇激素，参与繁殖过程的调控，包括性别分化、性成熟和其他方面，因此，体内雌二醇在空间和时间上的平衡对机体执行正确的机能非常重要［7-8］，对性腺的生长和发育起关键的调节作用。本研究中，作者首次克隆了虾夷马粪海胆CYP17 基因的cDNA 序列，并对该基因在不同家系雌、雄个体以及同一家系不同生殖腺发育阶段的表达进行了分析，旨在为今后利用该基因辅助育种培育虾夷马粪海胆优良品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 虾夷马粪海胆取自大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室。于2010年7月分别选取相同日龄的6 -2、10 -3、1 -3 家系虾夷马粪海胆(均为2008年10月培育)，于2010年8月4日、9月20日、10月25日选取日龄分别为430、477、512 d 的4 -1 家系虾夷马粪海胆(2009年5月底培育)，每次每个家系采样10 ～16 个，以保证每次每个家系有3 个雌海胆和3 个雄海胆。

1.1.2 主要试剂、药品 引物由宝生物工程(大连)有限公司合成;Taq DNA 聚合酶、dNTPs、M-MLV反转录酶、RNA 酶抑制剂、PMDT -19 载体、DNA 切胶回收试剂盒、Real - time RT - PCR反转录试剂盒、SYBR Primix Ex TaqTMⅡ试剂盒、EASY Dilution、RNase free H2O等购自宝生物工程(大连)有限公司;Trizol 试剂盒购自美国Invitrogen 公司;其他常规试剂均取自大连海洋大学基因工程实验室。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 活体解剖取出海胆性腺组织，迅速放入液氮中冻存，然后转移到-80 ℃冰箱中保存备用;同时取相同部位的生殖腺用Bouin's 液固定24 h 后，用体积分数为70%的酒精保存，用于组织切片的制备。

1.2.2 海胆性别的鉴定 采用组织切片技术，按照文献［9］中的方法对海胆的性别及生殖腺发育时期进行鉴定。

1.2.3 总RNA 的提取和cDNA 第一链的合成 提取3 个不同家系(6 -2 家系、10 -3 家系、1 -3家系)和同一家系(4 -1 家系)3 个不同发育时间段虾夷马粪海胆的总RNA，按照Trizol 总RNA提取试剂盒说明书方法进行总RNA 的提取。总RNA 质量检测合格后，用M -MLV 反转录酶按照试剂盒说明书方法合成cDNA 第一链。

1.2.4 虾夷马粪海胆CYP17 基因克隆的引物设计虾夷马粪海胆CYP17 基因cDNA 的引物设计、克隆及生物信息学分析参照文献［10］中的方法。

糜蛋白酶（Chymotrypsin）是从牛胰脏提取出来的一种白色或类白色粉末，能溶于水，其水溶液的pH为5.5～6.5，在pH3～5时最稳定，pH为7时活性最强，等电点为pH8.3。

1.2.5 虾夷马粪海胆CYP17 基因表达的引物设计和筛选 根据上述已克隆的虾夷马粪海胆CYP17基因的 cDNA 序列(GenBank 注册号为HM854853)设计表达分析的引物，内参基因18S rRNA引物参照文献［11］设计，引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR 引物设计Tab.1 Primers used for Real Time Quantitative PCR

1.2.6 反转录 使用PrimeScriptTMreagent kit 试剂盒进行海胆cDNA 第一链的合成，反应步骤按试剂盒说明书方法进行。

1.2.7 实时荧光定量PCR 实时荧光定量检测采用SYBR Green I 嵌合荧光法，选择相对定量中的△△CT比较法分析CYP17 基因的表达水平。

1)实时定量PCR 体系及反应条件。实时定量PCR 总体系为20 μL，其中包括10 μL SYBR Realtime PCR Master Mix、0.8 μL上游引物(10 μmol/L)、0.8 μL下游引物(10 μmol/L)、0.4 μL ROX Reference Dye(50 ×)、2 μL 模板cDNA和6 μL 无RNase 酶水。反应条件为:95 ℃下预变性10 s;95 ℃下预变性5 s，60 ℃下退火和延伸34 s，共进行40 个循环;最后在95 ℃下变性1 min，60 ℃下退火30 s，95 ℃下延伸30 s，形成溶解曲线。

2)标准曲线的建立。采用相对定量比较CT法，根据预试验结果选择表达量较高(高拷贝数)且均一稳定的标准品，分别建立内参基因和目的基因标准曲线，标准品初始浓度为25 ng/μL，进行倍比稀释，设置6 个稀释浓度，每个浓度设2 个重复。

3)模板的稀释。根据预试验结果，最佳模板浓度为12.5 ng/μL。以虾夷马粪海胆总RNA 反转录合成的cDNA 浓度为25 ng/μL，所有待测样品用EASY Dilution 稀释4 倍后备用。

4)实时定量PCR。使用Agilent Mx3000P 荧光定量PCR 仪，根据SYBR Primix Ex TaqTMⅡ试剂盒配制混合试剂，按照软件程序设定反应条件进行定量PCR。对每个样品均进行CYP17 基因(目的基因)和18S rRNA 基因(内参基因)的RT - PCR反应，同时进行3 个阴性对照的RT - PCR 反应，每个处理均重复3次。

1.3 数据处理

实时定量数据分析采用2-△△CT法，计算方法如下:

CYP17 基因表达的相对浓度

式中:Ct 为荧光信号达到设定的域值时的循环数;CtA、CtB分别为目的基因和内参基因的Ct 值;ExA、ExB分别为目的基因和内参基因的扩增效率。其中:

1)每个个体计算△CT=CtA-CtB;

2)计算雌性、雄性组海胆的△CT均值，选择△CT均值最高的一组，作为参照组;

3)每个个体计算△△CT=△CT(个体)-△CT(参照组);

2 结果与分析

2.1 虾夷马粪海胆的雌、雄鉴定结果

采用石腊组织切片技术，对相同日龄的6 -2、10 -3、1 -3 家系虾夷马粪海胆进行性别鉴定，结果表明，3 个家系的生殖腺均处于成熟前期。对3个不同日龄的4 -1 家系虾夷马粪海胆进行性别鉴定，结果表明，430、477、512日龄4 -1 家系海胆的生殖腺分别处于生长期、成熟前期和成熟期。4 -1 家系虾夷马粪海胆生殖腺发育的组织切片如图1所示。

图1 3 个不同日龄的4 -1 家系虾夷马粪海胆的生殖腺分期Fig.1 Representative morphology of the gonad in three different day sea urchin Strongylocentrotus intermedius family 4 -1

2.2 虾夷马粪海胆CYP17 基因的克隆与分析

2.2.1 虾夷马粪海胆CYP17 基因的序列分析 经克隆和生物信息学分析，得到了一条1 570 bp 的cDNA 序列，并递交到GenBank 数据库中(Gen-Bank 注册号为HM854853)。该基因的ORF(开放阅读框)自起始密码子ATG 至终止密码子TAA 全长为1 482 bp。该基因编码493 个氨基酸的蛋白质，其相对分子质量约为55 540，等电点为8.068。

2.2.2 虾夷马粪海胆CYP17 基因的同源性与进化树分析 使用Mega 4.0 软件将虾夷马粪海胆与其他18 个物种的CYP17 基因的氨基酸序列进行同源性比较。结果表明:与紫球海胆S.purpuratus 的同源性为97%，与光棘球海胆S.nudus 的同源性为96%，与囊舌虫Saccoglossus kowalevskii 的同源性为47%，与青鳉Oryzias latipes和斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus 的同源性均为37%，与鳗鱼Anguilla japonica、斑马鱼Danio rerio、红鳍东方鲀Takifugu rubripes和鸡Gallus gallus 的同源性均为36%，与蟾蜍Glandirana rugosa和斑胸草雀Taeniopygia guttata的同源性均为35%，与非洲爪蛙Xenopus tropicalis的同源性为34%，与安乐蜥Anolis carolinensis和响尾蛇Crotalus adamanteus 的同源性均为33%，与人Homo sapiens和牛Bos taurus 的同源性均为29%，与猪Sus scrofa和家鼠Mus musculus 的同源性均为28%。

通过对图2 的进化树分析可看出，3种海胆的氨基酸序列具有高度同源性，这说明海胆作为棘皮动物在CYP17 基因的氨基酸序列上具有种属特异性，且在进化过程中具有高度保守性。

图2 不同物种CYP17 氨基酸序列的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of CYP17 based on amino acid sequences in different species

2.3 虾夷马粪海胆CYP17 基因的表达差异

2.3.1 CYP17 基因在虾夷马粪海胆不同家系间的差异表达 本试验中随机选择3 个家系的虾夷马粪海胆，研究CYP17 基因在不同家系间同一生殖腺发育时期的雌、雄差异表达。从图3可见:3 个不同家系的虾夷马粪海胆CYP17 基因在雌、雄生殖腺成熟前期存在显著的差异表达;在雄性个体中，CYP17 基因在1 -3 家系的表达量最高，在6-2 家系的表达量最低;尽管CYP17 基因在雌性个体中的表达量相对较低，但与该基因在雄性个体中的表达量也有相对的比例。其中6 -2、10 -3、1-3 家系雄性海胆CYP17 基因的表达量与雌性海胆该基因的表达量比例约为158∶ 1、88∶ 1、218∶ 1。为准确了解雌性海胆CYP17 基因在不同家系间的差异表达，将图3 中雌性海胆该基因的表达水平放大，如图4所示。从图4可见:CYP17 基因在6 -2 家系的表达量最低;在10 -3 家系的表达量最高，约为6 -2 家系的3.85 倍;在1 -3 家系的表达量次之，约为6 -2 家系表达量的2.37 倍。

2.3.2 CYP17 基因在虾夷马粪海胆同一家系不同生殖腺发育时期的差异表达 CYP17 基因在虾夷马粪海胆4 -1 家系3 个不同发育时期雌、雄生殖腺表达结果如图5所示。3 个不同发育时间段中，CYP17 基因在雄性海胆生殖腺中的表达量均明显高于其在雌性海胆生殖腺中的表达水平，其中430、477、512日龄雄性海胆的表达量与雌性海胆表达量比例约为25∶ 1、33∶ 1、5∶ 1。CYP17 基因在雄性海胆性腺中的表达量随着日龄的增加而增加;而雌海胆性腺在发育第430天到第447天表达量略有增加，发育到第512天表达量明显增加。

图3 3 个不同家系虾夷马粪海胆雌、雄性腺CYP17 基因相对定量(以18S rRNA 为参照)Fig.3 Comparative quantities of CYP17 gene expressions in the ovary of three family strains of sea urchin S.intermedius

图4 3 个不同家系雌性虾夷马粪海胆CYP17 基因相对定量Fig.4 Comparative quantities of CYP17 gene expressions in the ovary of three family strains of sea urchin S.intermedius

图5 4 -1 家系虾夷马粪海胆不同发育时间段雌、雄性腺CYP17 基因相对定量(以18S rRNA 为参照)Fig.5 Comparative quantities of CYP17 gene expressions in the ovary of family 4 - 1 sea urchin S.intermedius in different development time

3 讨论

近年来，一些学者对海胆体腔液提取物、多糖等的分离和纯化、精子的超低温保存、生长代谢等方面进行了基础和应用研究［3，12-16］。由于海胆的可食用部分主要是生殖腺，因此，如何提高海胆生殖腺的产量和质量是海胆育种学家和广大生产者需要解决的重大课题。CYP17是性激素合成的关键酶，对动物性别决定、性别分化和生殖腺发育起着重要作用。所以，本研究中选择CYP17 基因作为虾夷马粪海胆生殖腺生长和发育的主要候选基因。

海胆的性别在外观或外形上难以鉴别，即使解剖观察生殖腺，在生殖腺成熟以前也难以鉴别雌、雄，需要通过组织切片技术鉴别雌、雄并进行生殖腺发育分期。本研究中通过组织切片技术进行海胆的性别鉴定和生殖腺发育时期的判别，得到了准确的结果。

本研究中首次克隆了虾夷马粪海胆CYP17 基因的cDNA 序列，其编码的氨基酸序列与紫球海胆和光棘球海胆的该氨基酸序列有高度的同源性，分别为97%和96%。高度的同源性反映了同类物种在进化上的高度相似性。

本研究中发现，虾夷马粪海胆CYP17 基因在3个不同家系和同一家系3 个不同发育时间段的雌、雄海胆生殖腺中均有表达，但在雄性海胆生殖腺中的表达量明显高于其在雌性海胆生殖腺中的表达量。由此说明，虾夷马粪海胆CYP17 基因与其生殖腺的生长和分化是有关联的。另一方面，CYP17基因是合成雄激素的关键类固醇激素生成酶，对雌激素的合成也是必不可少的，该基因在雄性海胆性腺中的表达量高于雌性海胆是符合这一点的。从4 -1 家系3 个不同发育时间段雌、雄海胆性腺组织表达情况来看，CYP17 基因在虾夷马粪雌、雄海胆性腺中的表达量随着日龄的增加而增加，其中雄性海胆3 个发育时间段的表达量变化较明显，而雌性海胆生长期和成熟前期表达量变化不显著，到成熟期表达量变化才开始显著，这可能是由于雌、雄海胆生殖腺发育不同步所致，雄性海胆的生殖腺发育要比雌性的快一些，或者说CYP17 基因在虾夷马粪海胆雄性生殖腺中表达量高。CYP17 基因在不同家系同一生长期或同一家系同一日龄雌、雄生殖腺的差异表达水平，说明了虾夷马粪海胆在同一生长期(或日龄)雌、雄个体生殖腺发育不同步，雄性海胆的生殖腺发育要比雌性快，这与董颖等［17］的研究结果是一致的。

本研究结果初步证实了CYP17 基因与虾夷马粪海胆生殖腺生长、发育有关，在不同家系间、同一家系不同发育阶段有较大的差异表达，且该基因在雄性海胆生殖腺中的表达水平显著高于在雌性海胆生殖腺中的表达水平。

致谢:辽宁省海洋水产科学研究院赫崇波研究员、周遵春研究员、杨爱馥副研究员在试验过程中给予了鼎力帮助，在此表示感谢!

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