刺参肠道潜在产酶益生菌的筛选和鉴定

杨志平，孙飞雪，刘志明，张磊，曹为，马悦欣

(1.大连汇新钛设备开发有限公司，辽宁 大连116039;2.大连海洋大学 农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连116023)

刺参Apostichopus japonicus是中国北方地区重要的海珍品之一，具有很高的营养价值和经济价值。随着刺参养殖密度的增加以及海水污染程度的恶化，各种传染性疾病也随之出现，给刺参养殖业造成了巨大的经济损失［1-4］。传统的疾病防治方法以使用抗生素为主，容易使细菌产生抗药性［5］，干扰水生动物肠道正常微生物区系［6］，还可能造成水产品中药物残留，对人类健康产生不利影响。已有研究表明，从健康动物体内分离具有产酶能力的微生物是筛选益生菌的有效途径［7-8］。潜在益生菌对刺参生长、消化、免疫的影响研究已有报道［9-12］。本研究中，作者从自然海域生长的健康刺参肠道组织筛选出几株产多种水解酶的细菌，并对其进行安全性试验和初步分类鉴定，旨在为刺参益生菌制剂的研发与应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用刺参样品于2010年5月和2010年11月分别采自大连柏岚子和黑石礁自然海域，体质量为10 ～30 g，共20 头。

1.2 方法

1.2.1 肠道细菌分离 将从海底取回的新鲜刺参以无菌解剖法取出肠道，在低温下将组织匀浆，并与适量的无菌海水充分混匀，稀释，取适宜的稀释液0.1 mL 涂布于TSA和MRS 培养基上，在20 ℃下恒温培养2 ～3 d，选取形态不同的菌落经划线纯化后接种于2216E 斜面上，并于4 ℃下保存。

1.2.2 菌株的产酶能力测定在淀粉培养基、海水酪素琼脂培养基、脂酶(Tween80)培养基以及产纤维素酶培养基上采用点种法测定菌株的产酶能力，以水解圈直径与菌落直径之比初步判定产酶能力。使用TSB 培养基对初筛菌株产酶进行定量测定，将菌株在TSB 中培养24 h 获得种子培养物，再将液体种子以2%的接种量接种于50 mL 液体培养基中，在25 ℃下摇瓶(150 r/min)培养48 h，以3 000 r/min 离心15 min，取上清液测定酶活力。采用淀粉-碘比色法测定淀粉酶活力，采用福林酚试剂法测定蛋白酶活力。

1.2.3 细菌溶血试验 将用TSA 培养基过夜培养的待测菌株点种羊血平板，于20 ℃下培养24 h，根据菌落周围透明圈的形成来判断溶血素的产生。

1.2.4 安全性试验 将刺参(1 ～2 g)饲养在盛70 L 过滤海水的100 L 塑料桶中，水温约14 ℃，暂养2 周。将80 头健康的刺参随机分为8 组，每组10 头，其中1 组刺参腹腔注射0.1 mL 浓度为107cfu/mL 的待测菌株菌液，1 个对照组注射等量的无菌生理盐水;3 组刺参每天投喂含细菌浓度为109cfu/g 的干饲料，3 个对照组刺参每天投喂基础饲料。饲料配方(干物质，质量分数):豆粕10%，鱼粉8%，马尾藻25%，脱胶海带粉30%，麦饭石10%，石粉16.5%，多维预混料0.5%，其营养成分:粗蛋白质16.32%，粗脂肪5.53%，粗纤维16.13%，粗灰分30.78%。试验期间每天按刺参体质量的5%投喂，每2 d 换水1/2 并吸底去除残饵及粪便。观察和记录一个月试验中刺参的发病和死亡情况。

1.2.5 菌株的鉴定 细菌DNA 的提取方法参考文献［13］，用引物对27f/1492r［14］对提取的DNA 进行PCR 扩增，50 μL 反应体系包含:5 μL 10 ×PCR Buffer，4 μL dNTPs，4 μL MgCl2(25 mmol/L)，上、下游引物(10 mmol/L)各2 μL，1.25 U Taq 酶，4 μL DNA 模板，28.75 μL ddH2O。反应程序为:94 ℃下预变性4 min;94 ℃下变性30 s，56 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸90 s，共进行30 个循环;最后在72 ℃下再延伸10 min。用10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，将PCR 产物送天根生化科技有限公司进行测序。

2 结果

2.1 刺参肠道细菌的产酶能力

从表1可见:从取自大连柏岚子海域刺参肠道分离出的13 株细菌(BC11 ～BC113)中，4 株无产酶能力，6 株产1种酶，3 株产2种酶;从黑石礁海域刺参肠道分离的37 株细菌(BC21 ～BC237)中，8 株无产酶能力，6 株产1种酶，10株产2种酶，12 株产3种酶，1 株产4种酶。

依据酶活力定性检测结果选出其中9 株菌进行酶活力测定，结果表明:淀粉酶活力为203.0 ～860.2 U/mL，其中BC28 菌株和BC210 菌株的淀粉酶活力最高;蛋白酶活力为65.9 ～148.7 U/mL，其中BC222和BC225 菌株的蛋白酶活力最高。

2.2 细菌溶血试验

依据产酶结果选 BC26、BC222、BC225、BC228、BC232和BC234 菌株进行溶血试验，结果6 株菌均不产生溶血素，但BC222、BC225和BC234 菌株产生α 溶血。

表1 刺参肠道菌株的产酶能力Tab.1 Qualitative extracellular enzyme activity of the bacterial strains isolated from the gut of sea cucumber

2.3 安全性试验

选用细菌BC26、BC228和BC232 菌株对刺参进行安全性试验，无论给刺参腹腔注射细胞浓度为107cfu/mL 的BC26、BC228、BC232 菌悬液，还是投喂含细菌浓度为109cfu/g 的干饲料，养殖一个月后，试验组和对照组刺参均无发病和死亡现象。表明3 株细菌在试验浓度下对刺参无毒力。

2.4 菌株的鉴定

将BC26、BC228和BC232 菌株的16S rDNA序列用Blast 软件在GenBank 数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行检索，调取相似性最高的序列。检测结果显示:BC26、BC228和BC232 菌株分别与芽孢杆菌Bacillus sp.FA132(JQ083325)、假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.NBRC102016(AB681663)和塔斯马尼亚弧菌Vibrio tasmaniensis 04102(AM422801)的相似性均为99%。

3 讨论

国内外学者研究证明，鱼类、贝类肠道中普遍存在产酶细菌［15-18］。王瑞旋等［15］对军曹鱼肠道异养细菌进行一周年的监测，分离得到94 株优势菌，并检测其产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的能力，结果显示，有8 株菌能同时分泌这3种酶。Bairagi等［16］对9种淡水鱼消化道产淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶和蛋白酶的细菌进行了研究，结果表明，从不同种鱼的肠道可分离出不同的产酶细菌。祝玲等［17］从近江牡蛎肠道中分离出21 株菌，并对其蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶的产酶能力进行测定，结果表明，产3种酶以上的有8 株菌。王志等［18］研究发现，在九孔鲍消化道中存在着能分泌蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶的微生物。这些研究证明，鱼类、贝类肠道除了内在的消化酶外，还有独特的细菌源消化酶，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶［15-18］，这有助于营养学家将产酶细菌作为益生菌，设计出低成本饲料配方。本试验中从刺参肠道分离出50 株细菌，其中产3种酶以上的细菌13 株，表明由肠道细菌补充刺参消化酶的可能性。Bairagi等［16］对从不同淡水鱼肠道分离出的其中10 株产酶细菌进行酶活力测定，其蛋白酶活力为1.6 ～23.8 U/mL。王福强等［19］从牙鲆肠道分离出25 株产蛋白酶的细菌，筛选出4 株产酶活力较高的菌株，其酶活力为2.19 ～4.47 U/mL。本研究中对从刺参肠道分离出的其中9 株产酶细菌进行酶活力测定，其蛋白酶活力为65.9 ～148.7 U/mL，高于从鱼类肠道分离出菌株的酶活力［15，19］。

在筛选潜在益生菌时，一般通过小规模体内试验检测候选菌株对宿主的致病性［20-22］。Kim等［20］从虹鳟肠道分离出Carnobacterium maltaromaticum B26 菌株和广布肉杆菌Carnobacterium divergens B33菌株，经腹腔注射、肌肉注射B26 菌株和B33 菌株的菌悬液以及投喂含二菌株的饲料对鱼体均无毒力。Aly等［21］给尼罗罗非鱼腹腔注射和肌肉注射从养鱼塘分离的Bacillus pumilus 菌株后鱼未出现发病和死亡现象。Abd El -Rhman等［22］通过给鱼体腹腔注射从尼罗罗非鱼的性腺和肠道分离的藤黄微球菌Micrococcus luteus 证明该菌株是安全的。本试验中，通过给刺参腹腔注射BC26、BC228和BC232菌株的菌悬液和投喂含3 菌株的饲料证明这些菌株是安全的。

Macey等［7］依据蛋白质和淀粉的降解能力从鲍鱼消化道筛选出潜在益生菌，在鲍鱼的养殖过程中投喂含此菌的饲料，结果与投喂不含菌的饲料组比较，试验组鲍鱼的生长率和存活率均有明显提高，其肠道中的蛋白酶活力也有明显增加。Bairagi等［8］在南亚野鲮Labeo rohita 的饲料中添加鱼肠道菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和环状芽孢杆菌B.circulans，结果鱼的生长、食物转化率和蛋白质效率增加，他们将这归因于由细菌产生的胞外纤维素和淀粉水解酶。周慧慧等［10］发现自刺参肠道分离的潜在益生菌Bacillus sp.GSC-1和Enterococcus sp.GSC-3可使稚参成活率、特定生长率和变色率显著提高。用添加外源或内源的枯草芽孢杆菌饲料投喂刺参，其生长和免疫力显著提高［11，23］。本研究中依据产酶能力、溶血试验和对刺参的安全性试验筛选出3 株对刺参无害的细菌，在刺参的养殖过程中投喂含菌饲料，可明显促进刺参的生长和抗病力，其结果将另文发表。

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