耐甲氧西林金黄色葡萄球菌异质性耐药株检测方法探讨

于 农，张 伟，陈建魁，宋世平，金 欣，左向华

随着抗生素的广泛应用，越来越多的细菌出现耐药，且耐药水平也越来越高。近年来具有多重耐药性的革兰阳性菌已在世界各地流行，其中最重要的病原菌之一为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。MRSA的形成是由于mecA基因编码产生了一个变异的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)［1］，其耐药基因呈均质性和异质性表达［2］，常规方法检测均质性表达的菌株不难，但对异质性MRSA(H-MRSA)菌株的检测尚无理想方法［2］。本文对H-MRSA的检测方法进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 军事医学科学院附属医院2011年10月—2012年10月临床各种培养标本中分离得到金黄色葡萄球菌共102株，均经过凝固酶试验及API鉴定系统(法国生物梅里埃公司)鉴定。质控菌株:甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)ATCC29213和MRSA ATCC43300，均购自卫生部临床检验中心。

1.2 方法

1.2.1 乳胶凝集法检测PBP2a:严格按试剂盒说明书进行操作(乳胶试剂盒由日本Deka-Seiken公司提供)，采用包被有抗PBP2a单克隆抗体的乳胶颗粒与生长于血平板上纯金黄色葡萄球菌菌落进行凝集试验。结果判断:出现凝集现象为阳性(产生PBP2a即 MRSA)，无凝集为阴性(即 MSSA)。以ATCC29213为阴性对照，ATCC43300为阳性对照。

1.2.2 肉汤稀释法检测MRSA:采用肉汤稀释法进行头孢西丁和苯唑西林最低抑菌浓度(MIC)试验，操作严格按美国临床和实验室标准协会(CLSI)标准执行。结果判断:头孢西丁MIC≥8μg/ml、苯唑西林 MIC≥4μg/ml为耐药，头孢西丁 MIC≤4 μg/ml、苯唑西林 MIC≤2 μg/ml为敏感［2］。以ATCC29213和ATCC43300分别作为敏感、耐药质控菌株。

1.3 菌群谱分析法检测H-MRSA 采用菌群谱分析法［2］，实验药物改为苯唑西林。阳性判断标准:生长率比值与对照质控菌株(ATCC43300)相等为阳性。

1.4 统计学分析 应用SPSS 10．3软件进行统计学处理，采用χ2检验，α=0．05为检验水准。

2 结果

2.1 MRSA检出率比较 头孢西丁耐药71株(69.6%)，其中PBP2a阳性70株(98.6%);苯唑西林耐药 80株(78.4%)，其中 PBP2a阳性 70株(87.5%)。头孢西丁耐药菌株PBP2a检出率明显高于苯唑西林，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 2种方法检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌结果(n=102)

2.2 H-MRSA检测结果 102株金黄色葡萄球菌中筛选出2株H-MRSA(22.2%)，均来自苯唑西林耐药而头孢西丁敏感的9株菌中，头孢西丁耐药菌株中未检出。

3 讨论

自1961年第1株MRSA在英国被发现［3］后，MRSA在全球迅速漫延，已成为医院感染的重要致病菌。由于多重耐药，MRSA引起的感染常难以治疗，因此被称为“超级细菌”。国内外文献报道，在金黄色葡萄球菌引起的感染中，MRSA占60% ～80%［4-6］，且逐年增高。快速、准确地检测MRSA对选用合适的抗生素具有重要意义。

MRSA的主要耐药机制是由于mecA基因表达了PBP2a，耐药性呈均质性和异质性表达。呈均质性表达的MRSA采用常规方法即可检出，但对HMRSA目前尚无理想检出方法［2］。异质性耐药菌株被认为是过渡表型［7］，体外药敏试验通常表现为低水平耐药甚至敏感而不易被检出［8］，但在一定条件下，尤其是使用抗生素后很快便会发展成为耐药菌株，临床治疗尤为棘手［7，9-10］。如果发生异质性耐药菌株的流行，感染菌株的处理势必将变成严重问题，目前世界范围内尚未制定出一套规范方法来治疗异质性耐药菌株的感染［11］，因此异质性耐药菌株的检出对于控制感染及预防扩散至关重要［11-12］。

基于PBP2a是MRSA耐药的根本原因，本研究以乳胶凝集法检测PBP2a结果为标准，比较金黄色葡萄球菌对头孢西丁与苯唑西林的敏感性，结果显示，102株金黄色葡萄球菌中头孢西丁耐药菌株中PBP2a阳性率为98.6%，苯唑西林耐药菌株中PBP2a阳性率为87.5%，头孢西丁检出MRSA的敏感性优于苯唑西林。这一结果与凝固酶阴性葡萄球菌表现相似，而与CLSI中对MRSA二者的敏感性和特异性差别不大的结论［13］不一致。

菌群谱分析法是CLSI认为鉴定万古霉素异质性耐药金黄色葡萄球菌的金标准，本研究借鉴这一方法，将万古霉素改为苯唑西林，苯唑西林浓度采用CLSI琼脂稀释法标准。用这一方法对102株实验菌株进行了H-MRSA检测，从9株苯唑西林耐药而头孢西丁敏感的菌株当中筛出了2株。由此认为苯唑西林对H-MRSA的敏感性优于头孢西丁。

由于试验步骤繁琐、流程长，且需手工操作，菌群谱分析法不易在临床推广使用，因此，临床实验室对常规方法检出的苯唑西林低水平耐药株应引起重视［14］，并提示临床注意观察和复检，力争尽早控制异质性耐药株感染。

［1］ 美国临床和实验室标准协会．抗菌药物敏感性试验执行标准 CLSI M100-S22［S］．中华检验医学杂志，2012，29(增刊):70-78．

［2］ 美国临床和实验室标准协会．需氧菌的稀释法抗菌药物敏感性试验CLSI M07-A9［S］．中华检验医学杂志，2012，29(增刊):27-28．

［3］ Jevons M P．Celbenin-resistant staphylococci［J］．B Med J，1961，242:124-125．

［4］ Hiramatsu K，Cui L，Kuroda M，et al．The emergence and evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］．Trends Microbiol，2001，9(10):486-493．

［5］ 黄辉，安如俊，周建党．移植患者呼吸道金黄色葡萄球菌感染的分子流行病学［J］．中华医院感染学杂志，2008，18(2):189-191．

［6］ Dumitrescu O，Dauwalder O，Boisset S，et al．Staphylococcus aureus resistance to antibiotics:key points in 2010［J］．Med Sci，2011，26(11):943-949．

［7］ 侯琦，马筱玲．细菌的异质性耐药［J］．临床输血与检验，2003，5(3):238-239．

［8］ Van Hal SJ，Wehrhahn M C，Barbagiannakos T，et al．Performance of various testing methodologies for detection of heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in bloodstream isolates［J］．J Clin Microbiol，2011，49(4):1489-1494．

［9］ Han JH，Edelstein PH，Lautenbach E．Reduced vancomycin susceptibility and staphylococcal cassette chromosome mec(SCCmec)type distribution in methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteraemia［J］．J Antimicrob Chemother，2012，67(10):2346-2349．

［10］张红旭，陈良安．异质性万古霉素中介的金黄色葡萄球菌耐药机制及临床意义［J］．中华医院感染学杂志，2012，22(17):3923-3925．

［11］张晨，金凤玲，朱海平．异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌的分离及检测方法的建立［J］．国际检验医学杂志，2012，33(13):1551-1553．

［12］Pitz A M，Yu F，Hermsen E D，et al．Vancomycin susceptibility trends and prevalence of heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in clinical methicillin-resistant S．aureus isolates［J］．JClin Microbiol，2011，49(1):269-274．

［13］美国临床和实验室标准协会．抗菌药物敏感性试验执行标准CLSI M02-A11［S］．中华检验医学杂志，2012，29(增刊):19．

［14］ Howden B P，Davies JK，Johnson P D，et al．Reduced vancomycin susceptibility in Staphylococcus aureus，including vancomycin-intermediate and heterogeneous vancomycin-intermediate strains:resistance mechanisms，laboratory detection，and clinical implications［J］．Clin Microbiol Rev，2010，23(1):99-139．