银杏叶提取物对氧糖剥夺诱导的体外培养大鼠星形胶质细胞损伤的影响*

牟芳芳 于永娟 张泽安 陆萍萍 邵水金

（上海中医药大学，上海 201203）

银杏叶提取物（EGb761）含有多种活性成分，具有清除自由基和过氧化脂质、扩张血管、改善循环、抗动脉粥样硬化以及神经保护等作用，广泛应用于治疗心脑血管系统疾病，对脑缺血缺氧损伤有保护作用［1-2］，但机理尚不完全清楚。星形胶质细胞是中枢神经系统主要组成细胞，负担了主要的细胞间物质和信号交流功能［3-4］。本研究采用体外原代培养的大鼠皮层星形胶质细胞，通过氧糖剥夺再复氧建立细胞损伤的模型，探讨EGb761对抗缺氧再复氧诱导星形胶质细胞损伤作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 金纳多注射液（17.5 mg/5 mL），台湾济生化学制药厂股份有限公司，DMEM、无糖DMEM、0.25%胰蛋白、D-Hanks液等购于Gibco公司，胎牛血清（Hy-Clone），多聚赖氨酸（Sigma），连二亚硫酸钠（Na2S2O4）购于上海国药集团化学试剂有限公司，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒，购于南京建成生物工程研究所，Bradford试剂盒、Western blot配胶试剂盒、PVDF 膜、WST-1、bcl-2、bax、caspase-3 抗体、二抗及ECL显色试剂盒等皆购于碧云天生物技术有限公司。

1.2方 法

1.2.1 星形胶质细胞原代培养 将出生24 h内的SD乳鼠处死后置75%酒精中浸泡5 min，取出带入无菌室，用消毒的手术器械取出脑组织，置于装有预冷DHanks液的无菌玻璃皿中，清洗3次，在解剖镜下用显微镊剥离脑膜，取出皮质，置于装有D-Hanks液的无菌小瓶中剪碎，弃去D-Hanks液，再用D-Hanks液轻柔吹打组织块2次后，将组织碎块转入0.25%的胰蛋白酶液的离心管内，放入37℃，5%CO2培养箱中30min，其间震荡1～2次。加入完全培养基 （20%FBS＋DMEM高糖＋100 U双抗）以终止消化，静置2 min后，用吸管吹打数次，形成初细胞悬液。经200目筛网过滤后加入培养瓶。置于培养箱30 min后，倒转培养瓶，吸出液体，利用差速黏附法去除成纤维细胞，进行细胞计数后，以1×106/mL的密度种入事先包被多聚赖氨酸的培养瓶中，置 37℃的 5%CO2培养箱中，2～3 d换液 1次，培养7～9 d后传代使用。细胞进行GFAP免疫荧光+Hoechst 33258复染法鉴定，第3代星形胶质细胞纯度>95%。

1.2.2 氧糖剥夺/复氧 （oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型建立及实验分组［5-6］在细胞约80%融合时，进行OGD/R实验。取弃去原培养液，用无糖DMEM轻洗1遍，加入终浓度为10 mmol/L的Na2S2O4无糖DMEM液，置于37℃，5%CO2孵箱中孵育90 min［以上为氧糖剥夺（OGD）］。取出培养板，弃去原液，加入正常培养液，放入37°C，5%CO2孵箱中孵育24 h［以上为复氧处理（R）］。实验分为3组。正常对照组：不经OGD/R，始终给予正常培养液。模型组：OGD 90 min，复氧24 h处理。EGb761组：EGb761终质量浓度分别为 25、50、100 μg/mL，于 OGD 前 1 h 加入，直至OGD/R实验结束。

1.2.3 细胞活力测定（WST-1法） 按WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书进行操作，96孔板每孔加入100 μL细胞悬液，使细胞数量为每孔6000个，培养24 h。各实验组进行OGD 90 min，复氧24 h后，每孔加入WST-1溶液10 μL。以加入相应量细胞培养液和WST-1溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照，每组5复孔，培养箱内继续孵育2 h。孵育结束后在全自动酶标仪上测定450 nm处的光密度值（OD），参考波长为620 nm。

1.2.4 培养液中LDH测定 乳酸脱氢酶 （lactate dehydrogenase，LDH）是一种广泛存在于所有细胞胞浆中的酶，此酶可因细胞受损后细胞膜通透性改变而大量渗漏至胞外，通过测定培养液中该酶的活力可间接判断细胞的受损程度。OGD结束后，不经再给氧处理，从培养板各孔取上清，按乳酸脱氢酶测定试剂盒说明书操作，在酶标仪450 nm波长下读取各孔OD值，计算各样本的平均值。LDH含量以U/L表示。

1.2.5 Hoechst 33258染色96孔板内，每孔加入6×104/mL细胞悬液100μL培养24h。各实验组进行OGD 90 min，复氧24 h后，吸尽培养液，每孔加入100 μL固定液，固定20 min，弃去固定液，0.01 mol/L的PBS洗两遍，每次2 min，吸尽液体。加入100 μL Hoechst 33258染色液，染色5min。弃去染色液，PBS洗两遍，每次2 min。直接在荧光显微镜检测，可见被染成蓝色的细胞核，其中活细胞核呈弥散均匀蓝色荧光，出现细胞凋亡时，染色质固缩，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。

1.2.6 细胞免疫荧光染色 将经过OGD/R以及EGb761孵育后的各组细胞，用4%多聚甲醛固定20min，PBS浸洗细胞3次，每次2 min，加入1%的BSA，37℃条件下孵育30min后，室温放置1 h，弃去BSA，加入GFAP 抗体（1∶100），对照组加入等量 PBS，4 ℃过夜。然后37℃条件下孵育2 h，PBS浸洗细胞3次，每次2 min，加入二抗，37℃条件下孵育1 h。经Hoechst 33258染核5 min后，在荧光显微镜下观察细胞。

1.2.7 Western blot检测 blc-2、bax、caspase-3 蛋白表达变化 经过OGD/R以及EGb761孵育后的六孔板上的各组细胞，每孔加入裂解液100 μL，经裂解、破碎、离心后，用Bradford法进行蛋白定量，调整各样品蛋白终浓度为 2 μg/μL。 取 20 μL 样品进行电泳、转膜、5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，滴加相应的一抗，4 ℃冰箱过夜：blc-2 （1∶1000）、bax （1∶500）、caspase-3（1∶500）、β-actin（1∶1000）。滴加相应二抗（1∶1000），室温孵育 2 h，PBS 清洗，加入 ECL，反应 1～5 min，使用Tanon 4500SF全自动数码凝胶化学发光图像分析系统和GIS 1D分析软件检测蛋白表达，与内参相比，进行组间统计分析。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。各组数据以表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同质量浓度EGb761对OGD/R诱导星形胶质细胞活力及LDH释放量的影响 生长状态良好的星形胶质细胞经过不同质量浓度EGb761孵育24 h后，WST-1测定细胞活性。结果显示（见图1）：当EGb761质量浓度低于50 μg/mL时，药物对细胞没有毒性作用，且对细胞具有一定的刺激增殖作用。当药物质量浓度大于100 μg/mL后，细胞活力随药物质量浓度的增高而逐渐降低。星形胶质细胞与EGb761共培养24 h后，进行OGD处理。LDH活性检测结果显示（见图2）：星形胶质细胞经OGD处理后LDH的释放与对照组比较明显升高（P＜0.01），与 EGb761（25、50、100 μg/mL）共培养24 h，能使LDH的释放量降低，与OGD组相比差异明显（P ＜0.01），而高质量浓度组（100 μg/mL）与低质量浓度组（25、50 μg/mL）相比，其 LDH 释放量又有增高的趋势。其结果提示：EGb761在一定质量浓度范围内能减轻OGD诱导的星形胶质细胞损伤。

图1 不同质量浓度EGb761孵育24 h对大鼠皮层星形胶质细胞活力的影响

图2 EGb761对星形胶质细胞OGD损伤LDH释放量的影响

为了观察EGb761与OGD/R（90 min/24 h）损伤对星形胶质细胞活性的影响，笔者用WST-1法进行检测，结果显示（见图3）：相较于正常对照组，经OGD/R处理后的皮层星形胶质细胞的OD值明显降低 （P＜0.01）。 而 EGb761 组（25、50 μg/mL） OD 值显著升高（P＜0.01），且高低剂量组间相比差异明显（P＜0.05）。其结果表示，EGb761能够减轻OGD/R导致的细胞损伤，提高细胞活性。

图3 EGb761对星形胶质细胞OGD/R损伤后细胞活性的影响

2.2 EGb761对星形胶质细胞OGD/R损伤后细胞形态的影响 （免疫荧光染色） GFAP（Glial Fibrillary Acidic Protein）是一种星形胶质细胞特异性的中间纤维蛋白，是星形胶质细胞的骨架蛋白。GFAP染色后，在荧光显微镜下观察（见图4）：模型组星形胶质细胞数量明显减少，细胞突起收缩、变少，相互之间的交联减少；EGb761组与模型组相比细胞数量增多，与正常对照组相比细胞形态变化较少，仍有较多突起，相互交联。这表明，EGb761在形态上对星形胶质细胞具有保护作用。

图4 EGb761对星形胶质细胞OGD/R损伤后形态变化

2.3 EGb761对OGD/R诱导大鼠皮层星形胶质细胞凋亡的影响 各组细胞进行Hoechst 33258染色。荧光显微镜下可见正常细胞核呈弥散均匀蓝色荧光，出现细胞凋亡时，染色质固缩，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。模型组凋亡星形胶质细胞所占百分比明显增高，与正常对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；EGb761干预后凋亡细胞明显减少（P＜0.01）；且高低剂量组之间亦有明显差异（P＜0.01）（见图 5）。

2.4 EGb761对OGD/R诱导星形胶质细胞损伤bcl-2、bax、caspase-3表达的影响 各组细胞用Westernblot法检测 bcl-2、bax、caspase-3蛋白。 细胞经 OGD/R损伤后，促凋亡基因bax蛋白表达增高，而EGb761能下调bax蛋白表达。相对bax表达变化，bcl-2变化较不明显（图6A）。一般认为bcl-2与bax形成异源二聚体调节细胞凋亡，而bcl-2/bax比值对决定细胞命运起关键作用，从图6B来看，OGD/R损伤使bcl-2/bax比值显著降低（P＜0.01），而给予EGb761发现bcl-2/bax比值明显升高（P＜0.01）。

同时，caspase-3作为凋亡程序启动的重要蛋白分子，如图6C所示，OGD/R诱导可使caspase-3激活，表达量比正常对照组增加约2.5倍 （P＜0.01），而给予EGb761则明显抑制了OGD/R导致的细胞caspase-3激活，与OGD/R相比有统计学意义（P＜0.01）。由此推测EGb761对大鼠皮层星形胶质细胞的保护作用可能通过调整bcl-2、bax蛋白表达，增加bcl-2/bax比值，抑制caspase-3激活，从而抑制细胞凋亡。

图5 EGb761对OGD/R诱导大鼠皮层星形胶质细胞凋亡的影响

图6 EGb761对星形胶质细胞OGD/R损伤后bcl-2、bax、caspase-3表达变化的影响

3 讨 论

多数缺血性脑血管病变的主要病理过程为脑缺血再灌注，在缺血中心区以细胞坏死为主，而在缺血边缘区（半暗带）尚存部分葡萄糖和氧，以细胞凋亡为主，半暗带发展趋势可能最终影响脑梗死体积［7］。研究证实EGb761能通过抑制炎症反应、清除氧自由基、抑制性氨基酸之间的动态平衡、抑制细胞凋亡等途径保护脑血管、减轻缺血性脑损伤［8］。在笔者前期试验中也已证实EGb761给药能减轻大脑中动脉缺血再灌注（MCAO）大鼠行为障碍，明显减少脑梗死体积，抑制MCAO大鼠海马caspase-3的表达，而TUNEL检测也表明，在缺血半暗带区凋亡的神经细胞数显著下降，证明了EGb76l通过抑制细胞的凋亡而发挥其神经保护作用［4］。

星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，其量远超过神经元，在中枢神经系统中神经元不可能离开星形胶质细胞而存在，因此不能脱离星形胶质细胞研究神经损伤的机制。有学者研究发现星形胶质细胞在脑损伤后的信号传递等十分重要的作用，其凋亡可以促成神经元的继发性死亡，从而导致梗死区的进一步扩大［9-10］。因此有效预防脑缺血后星形胶质细胞凋亡的发生，将很大程度上起到直接和间接的脑保护作用。

在以往的实验也发现EGb761能抑制MCAO大鼠脑皮质Cx43的磷酸化［4］，而星形胶质细胞上存在大量Cx43［11］。为了探讨EGb761的神经保护作用是否与星形胶质细胞有直接关系，笔者利用体外培养星形胶质细胞OGD/R损伤模型模拟机体缺血/再灌注损伤。本实验中，星形胶质细胞在OGD/R后，细胞形态发生明显改变，出现胞体脱落，突起减少、断裂，相互间交联减少，大量细胞崩解死亡。LDH漏出明显增加，细胞活性降低，也印证了星形胶质细胞严重损伤。EGb761能在一定质量浓度范围内刺激细胞增殖，并使OGD导致的LDH漏出减少，细胞活性增高，减轻细胞损伤，从细胞形态观察上也证实了这一点。同时，Hoechst 33258染色观察到OGD/R损伤可导致星形胶质细胞凋亡增多，而EGb761则能够减少OGD/R诱导的凋亡。

细胞凋亡与许多疾病的发生密切相关，bcl-2基因家族在细胞凋亡调控中具有重要作用，其家族主要包括抑制凋亡基因，如bcl-2和促进凋亡基因，如bax等。一般认为bcl-2与bax形成异源二聚体调节线粒体结构与功能的稳定性，调控线粒体促凋亡因子（如Cytc）的释放，从而构成重要的细胞凋亡调控点之一［12-13］。bcl-2/bax的相对比例决定了细胞在接受凋亡信号后是否发生凋亡［14］。本实验结果显示细胞经OGD/R损伤后，促凋亡基因bax蛋白表达增高，EGb761能下调bax蛋白表达。相对bax表达变化，bcl-2变化较不明显，但bcl-2/bax比值变化明显。OGD/R损伤可使bcl-2/bax比值明显增高，给予EGb761则明显逆转这种趋势。因此，推测EGb761抑制OGD/R诱导凋亡的机制可能与调节bcl-2、bax蛋白表达，调整bcl-2/bax之间的平衡有密切关系。

细胞凋亡虽然受高度程序化调控，但最终将由凋亡执行蛋白caspase-3来启动凋亡程序，caspase-3激活导致DNA断裂，核染色质浓缩，细胞凋亡［15-16］。由实验可知，OGD/R诱导可使caspase-3表达增加约2.5倍，EGb761可使OGD/R损伤后的细胞caspase-3表达量显著降低。结果表明EGb761可抑制caspase-3激活从而对抗OGD/R诱导的星形胶质细胞凋亡，这可能是其抗细胞凋亡作用机制的环节之一。

综上所述，EGb761能够改善OGD/R诱导的星形胶质细胞损伤而发挥神经保护作用，这一作用的发挥可能与调整bcl-2/bax之间的比值平衡、caspase-3激活从而对抗OGD/R诱导细胞凋亡有关。

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