顶空固相微萃取-气质联用及电子鼻技术检测中华绒螯蟹不同可食部位中的香气成分

顾赛麒，王锡昌，陶宁萍*，张晶晶

(上海海洋大学食品学院，上海 201306)

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗名大闸蟹，又称河蟹、毛蟹，地域上北起辽河而南至珠江，在各地通海河流及湖泊均有分布，具有较高经济价值。2010年全国产量为59.33万t，产值突破300亿元[1]。中华绒螯蟹因其生长环境的不同，可进一步区分为“湖蟹”、“江蟹”、“塘蟹”等，文献[2]报道中华绒螯蟹会因其生长地域的不同而导致其风味成分存在一定差异性[2]。上海市松江地区历来均有养殖中华绒螯蟹的传统，其出产的中华绒螯蟹曾多次参加国内举办的河蟹评比大赛，深受专家及广大消费者好评，但目前国内尚无对其风味成分的报道。

风味物质是指一类能为人体感觉器官所感知的水溶性或挥发性的低分子质量化合物。前者一般称为呈味物质，种类相对固定，可刺激人味蕾细胞产生酸、甜、苦、咸、鲜等感觉，目前对其研究较为透彻；而后者又可称为香气物质，通常需在一定条件下(如加热、酶催化等)由风味前体物质转化而来。风味前体物质指经热加工后可转化成香气物质的组分，一般由两大类构成：水溶性成分(氨基酸、肽类、碳水化合物、核苷酸、硫胺素等)和脂溶性成分(脂质等)。风味前体物质的复杂性与交互反应性，决定了香气物质的极端多样性，目前在水产品中经鉴定得到的香气物质已达上千种之多。

不同的香气物质通常具有不同的感官特性，多种香气物质共同作用构成了中华绒螯蟹的整体风味轮廓，并显著影响其综合感官品质。此外，消费者在品尝蟹样前首先嗅闻其香气，香气物质的可接受性将直接影响消费者对蟹样的喜好程度。同时，消费者咀嚼样品时，口腔内部温度对破碎后的肉样可起到类似“加热”的效果，有利于其内部的香气物质充分挥发并再次进入鼻腔形成“鼻后香”，使消费者对蟹样香气的感知更为全面。

自20世纪90年代以来，国外学者对蓝蟹、雪蟹等海水蟹类的挥发性风味成分做了一定的研究报道[3-18]，鉴定得到了一些香气物质，但研究时主要采取的是同时蒸馏萃取法(simultaneous distillation-extraction，SDE)。SDE法由于提取温度较高、提取时间长、提取过程中容易造成某些易挥发性风味成分的流失从而造成蟹类整体风味成分的变化[19]。近年来，针对于有复杂介质或含协同效应挥发性成分的样品而建立起来的气味指纹技术也已运用于水产品风味方面的检测，其中电子鼻(electronic nose)作为一种集分析、识别、检测复杂挥发性成分功能于一体的新型仪器，具有客观、准确、重复性好及无损等优点，而顶空固相微萃取-气质联用法(headspace solid phase micro-extraction coupled with gas chromatography and mass spectrometry，HS-SPME-GCMS)则能够对挥发物进行精确定性、定量，故而越来越受到人们的重视[20-21]，故本实验采取上述两种方法对松江出产的中华绒螯蟹不同可食部位中的香气成分进行研究，期望可为构建完整的中华绒螯蟹风味物质库提供相关实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中华绒螯蟹：2011年10月下旬，从上海市松江区鱼跃公司养殖基地采集二级雌性大闸蟹20只。活蟹捕捞出水后立即用麻绳扎紧(防止其剧烈挣扎造成营养物消耗)，放置入底部铺冰的泡沫箱内迅速带回实验室。

Fox 4000 Sensory Array Fingerprint Analyze电子鼻法国Alpha MOS公司；6890-5975B气质联用仪 美国Agilent质谱公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器巩义市予华仪器有限责任公司；手动进样手柄、萃取头(碳分子筛(CAR)/二甲基硅氧烷(PDMS)，涂层厚度75μm)美国Supelco公司；15mL棕色顶空萃取瓶 上海安谱科学仪器有限公司。

1.2 样品前处理方法

将捆扎好的中华绒螯蟹从泡沫塑料箱中取出，以自来水冲洗去表面的泥沙等杂质，用毛巾擦拭干净，依次放入不锈钢蒸锅内蒸制30min。取出蒸熟蟹样，冷却至室温，打开头胸甲，手工剥离性腺；剪开蟹螯，刮取钳肉；剪开步足，刮取足肉；剪开头胸甲底部内骨骼，刮取体肉；将体肉、钳肉、足肉、性腺样品收集至同一个食品级密实袋中并做标记。待4部位样品收集完毕后，用经消毒程序处理(刀口经火焰灼烧10s后再紫外辐照30min)的绞肉机将每一密实袋中的体肉、钳肉、足肉、性腺充分绞碎至均匀，精确称取每份质量为(2.00±0.01)g和(6.00±0.01)g的绞碎后肉样，分别装入5mL电子鼻进样瓶和15mL棕色顶空瓶中备用。

1.3 电子鼻检测

将电子鼻进样瓶于50℃平衡10min后，以洁净干燥空气为载气，流速150mL/min，进样体积2500mL，1s进样完毕，注射针温度60℃，数据采集时间120s，延滞时间10min。

1.4 GC-MS检测

1.4.1 顶空固相微萃取

将内装样品的顶空瓶置于室温条件下平衡10min后，以SPME针管插入顶空瓶的硅橡胶瓶垫，伸出75μm CAR/PDMS萃取头，在沸水浴条件下吸附50min。待吸附完毕，取出插入GC-MS进样口，240℃解吸5min，热脱附进行GC-MS 检测。

1.4.2 GC-MS条件

色谱柱：DB-5MS弹性毛细管柱(60m×0.32mm，1μm)；不分流模式，起始柱温40℃，无保留，然后以5℃/min升至100℃，无保留；再以3℃/min升至180℃，无保留；接着以8℃/min升至240℃，保留5min。载气为He，流量1.0mL/min；汽化室温度240℃。质谱条件：电子电离(electron ionization，EI)离子源；电子能量70eV，灯丝发射电流为200μA，离子源温度为200℃，检测器电压1.2kV。

1.4.3 挥发物的定性及定量方法

定性方法[6]：1)将挥发物质谱图与NIST和Wiley(2008)标准谱库进行匹配，仅报道正、反匹配度大于800(最大值为1000)的鉴定结果。2)根据挥发物的保留时间计算保留指数(RI)，计算公式如式(1)：

式中：tR(x)、tR(n)、tR(n＋1)分别为待测挥发物、含n及n＋1个碳原子的正构烷烃的保留时间，将计算得RI值与文献报道的进行比对。

定量方法[22]：将2μL原始含量为1000mg/g的内标物2,4,6-三甲基吡啶(2,4,6-trimethyl pyridine，TMP)加入6g中华绒螯蟹样品中，通过计算待测挥发物与TMP的峰面积之比求得其含量(假定各挥发物的绝对校正因子为1.0)，计算公式如式(2)：

1.5 数据处理方法

电子鼻数据的PCA分析由仪器自带的AlphaSoft V 12.0软件处理，GC-MS数据的PCA和CA分析由SPSS 19.0完成，香气物质差异显著性分析由法单因素方差分析(One-Way ANOVA)中的LSD法完成。

2 结果与分析

2.1 电子鼻结果分析

图1 中华绒螯蟹体肉、钳肉、足肉及性腺电子鼻数据PCA分析图Fig.1 Principal component analysis chart for E-Nose data of abdomen,claw and leg meats and spawn in Eriocheir sinensis

由图1可见，第1主成分PC1与第2主成分PC2贡献度之和均在95%以上。表明不同部位的中华绒螯蟹蟹肉、性腺香气成分差异明显，而此差异能在PC1、PC2构建的平面上充分展示。图1显示电子鼻区分指数为81，区分指数(discrimination index，DI)最大值为100，其值越大表明不同组数据之间区分度越好，一般≥80表示能够有效区分。本图中DI值为81，表明不同部位的中华绒螯蟹蟹肉、性腺电子鼻数据组之间无重叠，区分度较好。

进一步分析图1可见，雌性中华绒螯蟹不同部位的电子鼻数据点均能较好区分开，且其分布存在一定规律性：性腺的香气较为特殊，其数据点与3种蟹肉数据点距离较远，且差异主要体现在第1主成分轴上(PC1贡献率达87.12%)。相对而言，体肉、钳肉和足肉的数据点相对集中，其差异性主要体现在第2主成分轴上(PC2贡献率较小，仅为9.15%)，表明其整体香气轮廓较为相似。

2.2 GC-MS结果分析

2.2.1 中华绒螯蟹不同部位中香气物质鉴定

运用HS-SPME-GC-MS法对采自松江的二级雌性中华绒螯蟹体肉、钳肉、足肉及性腺中的香气物质进行检测，所得结果见表1。本实验共鉴定得到48种化合物：醛类21种、酮类5种、醇类3种、芳香类4种、呋喃类5种、含氮类2种、烃类8种。中华绒螯蟹体肉、钳肉、足肉和性腺中分别检测到28、32、33、38种香气物质，其中有24种物质在4个部位中同时出现(以*标注)。48种香气物质除乙醛等7种外，其余41种在研究蟹类风味的外文文献中均有报道。此外，由表1可知，体肉、钳肉、足肉和性腺中香气物质的浓度值总和呈递增趋势，并均具有显著性差异(P＜0.05)。

然而，香气物质浓度值高低并不能直接反映消费者对其的“感受强度”，还必须考虑阈值的影响，通常把人能感受到某种香气物质的最低浓度称为“阈值(threshold)”。浓度一定时，阈值越低的化合物越容易被感知；阈值一定时，浓度越高的化合物越容易被感知。由此，消费者对各香气物质的“感受强度”最终可通过该化合物的浓度值除以阈值得到，将此比值命名为“活性值(odor activity value，OAV)”，OAV具体含义为某香气物质浓度超过自身阈值的倍数，OAV＞1时可认为此香气物活性较高，可进一步定义为“活性香气物质”。

2.2.2 中华绒螯蟹不同部位中活性香气物质分析

表2展示了中华绒螯蟹体肉、钳肉、足肉和性腺中的活性香气物质。癸醛等12种化合物为4部位所共有，且OAV均大于1(在阈值之上)，可认为其对中华绒螯蟹整体香气轮廓贡献显著。进一步分析表2可知，此12种物质中有9种是C5～C10的饱和及不饱和醛类，醛类一般是脂质的热降解产物，而烯醛和二烯醛则来源于亚油酸酯和亚麻酸酯的氢过氧化物的降解，通常具有青香、果香、坚果香和奶酪香等香气[23]。3～4个碳原子的醛具有强烈的刺激性风味，5～9个碳原子的醛具有清香、油香、脂香风味，碳链更长的醛类虽表面上没有可检测到的芳香，但其可作为其他重要芳香化合物的前体(如杂环化合物)。饱和的直链醛常有令人不快的、辛辣的、尖刺的和刺激性的气味并带有油的和蜡的特征气味。多不饱和脂肪酸的氧化产生各种醛(如辛醛和壬二烯醛)，是肉制品中构成各种氧化风味的重要来源[24]。苯甲醛是由氨基酸的斯特克雷尔氨基酸反应生成的，已被鉴定为烤花生仁的主要单羰基化合物，被感觉有令人愉快的杏仁香、坚果香和水果香，是存在于小龙虾尾肉和蟹肉中的一种重要风味挥发物，而3-甲基丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和癸醛等作为低阈值醛类，据报道[24]此类醛类即便在痕量条件下，也有一种很强的与许多其他风味物质重叠的风味效应，对构成蟹肉香味具有重要贡献。

表1 中华绒螯蟹体肉、钳肉、足肉及性腺中的香气物质Table 1 Aroma compounds identified in abdomen, claw and leg meats and spawn of Eriocheir sinensis

表2 中华绒螯蟹体肉、钳肉、足肉和性腺中活性香气物质(OAV＞11))Table 2 Aroma-active compounds in abdomen, claw and leg meats and spawn of Eriocheir sinennssiis s (OAV ＞ 11))

同时，对于上述12种活性香气物质，其感官特征在文献中被描述为：油脂味、鱼腥味、青草味、奶油味及烧烤味等，此结果与陈德慰[23]对中华绒螯蟹所做的感官评定结果较为一致，表明本实验结果可信度较高。此外，除癸醛等12种物质外，2,4-癸二烯醛(E,E)、三甲胺、2,6-壬二烯醛、2-甲基丁醛此4种化合物虽不为中华绒螯蟹4部位所共有，但其OAV在某一部位中处于优势地位(排名前10)，故在表2中也将其展示。

2.2.3 特征性活性香气物质分析

图2 主成分载荷图Fig.2 Biplot of principal component analysis (PCA)

图中“样品点”和“箭头”分别代表中华绒螯蟹4部位的“总体香气轮廓”及“每一香气变量”在第1、第2主成分上的投影(“样品点”参照主级横纵坐标轴，位于图内部，量程为[-4.0,4.0]，括号内数字代表得分排名；“箭头”参照次级横纵坐标轴，位于图外部，量程为[-1,1])。“箭头”与原点距离代表其被第1、第2主成分解释的程度；“样品点”与“箭头”在主成分空间中越接近，则表示两者的相关程度越高(首先看是否处于同一象限，其次看两者在同一象限中与坐标轴的夹角是否接近)，由此可判断中华绒螯蟹不同部位的特征香气成分[25-28]。

由图2可见，性腺样品点位于右下区域(第4象限)，2-乙基呋喃(F2)、己醛(Q7)、壬醛(Q15)3种活性香气物质与其相关性显著；钳肉和足肉样品点位于左上区域(第2象限)，前者与柠檬烯(H2)关联密切，后者与癸醛(Q18)相关性较高；体肉样品点位于左下区域(第3象限)，没有与其相关的活性香气物质，分析原因可能是体肉中这12种活性香气物质的OAV相对较小。3-甲基丁醛(Q2)、4-庚烯醛(Q9)、庚醛(Q10)、苯甲醛(Q11)、辛醛(Q12)、癸醛(Q18)和2-戊基呋喃(F4)7种活性香气物质位于第1象限，没有与之相对应的样品点，分析原因可能是此7种物质OAV并无在某一部位中特别突出。综合上述分析结果，可得到5种表征中华绒螯蟹风味特性的特征性活性香气物质。

图1、2分别展示了电子鼻和GC-MS的主成分分析结果。这两种仪器均能用于水产品香气成分的分析，前者擅长对样品整体香气轮廓进行区分，而后者可以检测样品中所含的具体香气组分。由图1、2可见，电子鼻和GC-MS的主成分分析结果较为一致：3种蟹肉(体肉、钳肉和足肉)的香气轮廓较为接近，而性腺的香气轮廓较为特殊。此外，图1、2结果也有存在一定差异性：图2中体肉样品点距离钳肉和足肉较远，而在图1中3者彼此接近，究其原因可能是电子鼻和GC-MS的工作原理及仪器灵敏度存在差异。

采用SPSS 19.0软件，以“类间平均距离法”作为测量方法，以“夹角余弦”作为评价指标，对表1中筛选得到的12种活性香气物质的OAV数据进行聚类分析[29]，结果见图3。图3中“0～25”的标度是将检测对象的评价指标按统一尺度映射后的结果。可知，当标度为10时，可将12种活性香气物质聚为3类：柠檬烯(H2)为一类，2-乙基呋喃(F2)、己醛(Q7)、壬醛(Q15)和戊醛(Q4)为一类，剩余7种活性香气物质为一类。将图3聚类分析的结果与图2主成分分析的结果进行对比后可发现：聚得的3类香气成分中，每一类中均独立含有(不同时兼有)代表某一可食部位的特征性活性香气物质，表明两种分析方法可相互印证、互为补充。

图3 中华绒螯蟹活性香气物质聚类分析图Fig.3 Plot of cluster analysis (CA) of aroma-active compounds

3 讨论与结论

本实验运用顶空固相微萃取-气质联用及电子鼻技术检测了采自松江的二级雌性中华绒螯蟹体肉、钳肉、足肉和性腺的香气成分。电子鼻结果显示，中华绒螯蟹不同部位香气轮廓存在一定差异性，可进行明显区分。采用GC-MS从中华绒螯蟹4个可食部位中共检测到7大类48种香气物质。通过查找各香气物阈值并计算其活性值，确定了其中对中华绒螯蟹各部位整体香气轮廓贡献显著的12种活性香气物质(OAV＞1)，多为饱和及不饱和醛类，且均获多篇外文文献证实。

对中华绒螯蟹体肉、钳肉、足肉和性腺中的12种活性香气物质的OAV进行主成分分析和聚类分析，由主成分分析得到：2-乙基呋喃(F2)、己醛(Q7)、壬醛(Q15)为表征中华绒螯蟹性腺的特征性活性香气物质；柠檬烯(H2)和癸醛(Q18)分别是表征钳肉及足肉的特征性活性香气物质。由聚类分析得到：12种活性香气物质可聚为3类，且每类都独立含有代表某一特定部位的特征性香气物质。

本研究针对非阳澄湖出产的、品质同样出众的松江中华绒螯蟹4个可食部位中所含的香气成分进行了较为全面的分析，提出了一种结合多元统计分析方法鉴定水产品特征性活性风味物质的新思路，为今后成功构建完整的中华绒螯蟹“风味物质库”提供了相关实验依据。

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