抑郁大鼠海马神经干细胞增殖与分化的实验观察研究

马江波杨治明

抑郁大鼠海马神经干细胞增殖与分化的实验观察研究

马江波1杨治明2

目的研究长期应激刺激的未成年鼠海马神经干细胞的增殖与分化。方法选取未成年大鼠32只，分为模型组16只（增殖组和分化组各8只）和对照组16只（增殖组和分化组各8只），利用三重免疫荧光染色技术观察海马齿状回神经干细胞的增殖与分化情况。结果海马齿状回神经干细胞的增殖情况为模型组BrdU阳性细胞显著减少（P＜0.05）；两组BrdU阳性细胞的分化无明显差异性（P＞0.05）。结论抑郁症与未成年大鼠海马神经干细胞的增殖有相关性，可致增殖降低。

未成年抑郁症；海马；神经干细胞；增殖；分化

抑郁症是一种常见的严重危害人们身心健康的精神障碍疾病。在我国，各类精神障碍患者已超过8300万人，而在各种精神疾患中，抑郁症的致死率排名首位。专家预计，到2020年抑郁症将可能成为继癌症之后人类的第二大杀手[1]。青春期抑郁症是一种常见精神科疾病，表现为情绪低落、注意力不集中、精力下降、悲观绝望、无助等症状，严重抑郁可导致长期生理、心理等一系列问题的出现[2]。有研究结果表明，青少年抑郁症发病率为 8.3%[3]，而我国青少年大约有37%伴有不同程度的心理问题[1]，严重影响青少年的身心健康、学习以及成长，且增加了社会与家庭负担，近年来的诸多研究证实，应激性事件是抑郁症的明显促发因素，慢性、低强度、长期的日常压力是引发抑郁的主要原因[4]。目前国内外广泛采用应激（尤其是慢性轻度不可预见的应激）模拟造成抑郁症的压力源来制作抑郁动物模型，其机理与人类抑郁症发病机理相接近。而与学习、记忆、情感的生理功能密切相关的海马组织也会受其影响，在形态体积等方面发生变化[5]。本实验利用长期不可预见性刺激结合孤养造成未成年大鼠抑郁模型，并利用三重免疫荧光染色技术研究长期应激刺激的未成年大鼠海马神经干细胞的增殖与分化，以期了解未成年抑郁大鼠在应激状态下海马神经干细胞增殖分化的情况。

1 资料与方法

1.1 研究方法实验分为模型组16只，分为增殖组和分化组各8只；对照组16只，分为增殖组和分化组各8只。模型组大鼠单笼饲养，共接受为期21天的不同刺激，其中包括电击足底（电流强度1mA，电压45v，每隔1min刺激1次，每次持续10s，共30次）；摇晃（每秒1次，15min）；冰水强迫游泳（4℃，5min）；热水刺激（45℃，5min）；夹尾（1min）；禁水（24h）；禁食（24h），睡眠剥夺（48h）；常温强迫游泳（5min）。实验过程中每天给予一到两种，整个模型制造过程中每种刺激至少给予2次，同一种刺激不连续出现，使动物不能预料刺激的发生。对照组不接受任何刺激，自由摄食饮水。在实验过程中，模型组实验动物单只独笼饲养，对照组群养，刺激在另一个房间内给予，该房间的光照、温度基本与饲养间一致，刺激完毕后送回饲养间。

1.2 组织处理增殖组在应激刺激完成 24h后给药，BrdU（100mg/kg），腹腔注射，注射后存活24h，灌注固定，取脑组织。分化组在应激刺激完成 24h后给药，BrdU（100mg/kg），腹腔注射，注射后存活4周，灌注固定，取脑组织，分别经10%、20%蔗糖磷酸盐缓冲液脱水处理后取出海马中后部分（约2mm），液氮冷冻后-80℃保存。

1.3 免疫荧光检测技术分析将固定的海马组织利用全自动振动切片仪（LEICA TV1000S）沿冠状断面连续切片，片厚50μm，每只动物取10张切片进行染色。增值组用抗BrdU荧光抗体标记，显微镜下计数；分化组用三重免疫荧光染色，抗BrdU/NeuN/S100β分别标记阳性颗粒细胞（红色）、神经细胞（蓝色）和胶质细胞（绿色），显微镜下计数。

1.4 统计学分析建立 Excel数据库，采用 SPSS 17.0统计学软件分析，计数资料差异性比较采用χ2检验。以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 海马 BrdU阳性细胞增殖情况模型组未成年鼠海马神经干细胞的增殖情况显示，模型组（11.40±4.68），对照组（25.36±11.42），模型组BrdU阳性细胞显著减少，与对照组比较存在明显差异（P＜0.05）。

2.2 海马BrdU阳性细胞分化情况海马BrdU阳性细胞分化的定量结果显示，模型组与对照组无明显差异，两组转化为神经元的比例分别为 89%和88%，转化为胶质细胞的比例分别为10%和9%。

3 结论

海马是边缘系统重要组成部分，是下丘脑-垂体-肾上腺轴应激反应的高位调节中枢，在情绪、学习、记忆以及行为、免疫等方面都具有调节功能。海马组织的损伤在各种应激所致的抑郁症模型中起到关键作用[6,7]。研究表明，长期的应激刺激能使机体产生学习和记忆障碍、精神紊乱、痴呆、加速衰老、免疫力低下等多系统疾患，而这些疾患无一不是与下丘脑-垂体-肾上腺轴持续亢进，血中糖皮质激素水平升高密切相关。有MRI研究变明，重症抑郁患者双侧海马体积较之正常者显著减小，且减小程度与抑郁持续时间呈正相关，这可能与高浓度皮质酮诱导单胺能神经元糖皮质激素受体下调，脑海马神经元减少有关，因为糖皮质激素有神经元毒性[8,9]。成年哺乳动物海马脑区神经干细胞增殖的降低是导致抑郁症发生的重要因素，抑郁症的发病机理有可能是各种应激最终抑制或减缓了海马神经干细胞增殖[8,9]。有研究发现，慢性不可预见性中等强度应激后海马结构神经元和星形胶质细胞数量较正常对照组明显下降，细胞排列紊乱，神经发生被抑制，电镜观察示神经细胞超微结构受损[9]。

本实验观察到模型组未成年抑郁大鼠海马齿状回颗粒细胞层BrdU阳性细胞数较对照组明显减少，但细胞分化未见明显改变。对未成年抑郁症患者海马脑区神经干细胞增殖与抑郁症的关联性仅进行了有力的证据补充，但由于实验样本、方法和技术的限制，阐明长期应激刺激、抑郁和海马组织内干细胞增值降低三者之间的因果关系还需要进一步的实验研究加以探索。

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R749

A

1673-5846(2013)09-0168-02

1宁夏医科大学基础医学院人体解剖学教研室，宁夏银川 750004

2宁夏石嘴山市第二人民医院神经内科，宁夏石嘴山 753000