核酸与死亡时间的相关性及其检测方法

张志宏，袁雅洁

（厦门市公安局 刑事科学技术研究所，福建 厦门361003）

死亡时间在法医学上是指死后经历时间或称死后间隔时间（postmortem interval，PMI），即发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔。死亡时间推断即推测死亡至尸体解剖时经历或间隔时间[1]。目前主要根据尸温、尸斑、尸僵、角膜改变、胃内容物消化程度、膀胱尿量、尸体昆虫生长规律等方法推断早期和晚期死亡时间。但是，这些推断方法受主观经验和客观条件影响较大，结果存在一定的误差，难以满足法医工作复杂多变的需求。

躯体天然存在的核酸有两类，一类是脱氧核糖核酸（DNA），存在于细胞核和线粒体内；一类是核糖核酸（RNA），存在于细胞质和细胞核内。躯体死后，组织自溶，DNA降解，直至消失。自然界普遍存在RNA酶，使RNA易发生降解而不适合推断死亡时间，但是，近年来的研究进展表明，mRNA具有一定的稳定性，其降解过程与死亡时间密切相关[2]。

随着分子生物学检验手段和计算机、光谱等技术的发展及其在法医学中应用，根据躯体死后DNA和RNA的降解规律，测定组织细胞的核酸含量推断死亡时间，逐渐成为一种新方法。

1 躯体死后DNA和RNA含量的变化规律

1.1 躯体死后DNA含量的变化规律

国内外学者对躯体死后DNA含量变化做了大量研究，早在1973年Kiliovska等[3]发现猪死后0～72h内，肌肉细胞核DNA含量随着PMI的延长而有规律下降。1998年Di Nunno等[4]应用流式细胞技术检测脾组织细胞DNA含量在死后72h内逐渐下降，表明DNA含量与死亡时间有较强的相关性；1999年Di Nunno等[5]将上述研究成果应用于一起枪杀命案，为法医实践中推断死亡时间提供了一种新方法。1999年王慧君等[6]应用流式细胞技术检测大鼠死后0～96h的骨骼肌、脾、肾细胞DNA含量，发现随死亡时间延长，各组织细胞DNA完整片段减少、碎片增多。2000年刘良等[7]相继报道了特殊染色结合计算机图像分析技术检测大鼠的脑、肝、肾、脾、肺及心肌等细胞核DNA含量，取得了和上述研究一致的结果。2005年舒细记等[8]应用计算机图像分析技术检测32例已知死亡时间的尸体在死后5～36 h脑细胞DNA含量，发现人脑细胞DNA含量随死亡时间延长有规律下降。2006年罗光华等[9]应用特殊染色结合计算机图像分析技术研究150例人离体胸骨标本DNA降解与腐败尸体死亡时间的相关性，发现胸骨骨髓细胞核DNA含量随着死亡时间延长呈直线相关逐渐下降，死后2周DNA含量达最低值，该方法可以用于晚期死亡时间推断。2009年刑浩伟等[10]应用改良的Feulgen法结合计算机图像分析技术检测大鼠死后35d内肋软骨细胞核DNA含量，发现死后1～28d，细胞核染色逐渐变淡，至35d时已观察不到，该方法可以推断较长的晚期死亡时间。2010年熊平等[11]利用激光共焦显微拉曼光谱技术，检测人死后不同时间段肾、肝、脾等组织DNA含量，同样表明机体死亡后上述组织细胞DNA含量随死亡时间延长呈线性相关下降趋势。

以上研究，虽然检测DNA的方法不同，但都得出相同或相近的结果；即不同的组织器官DNA含量变化与死亡时间的相关性有所差别，相同时间段不同组织器官DNA降解速度有一定差异，但总体而言，DNA含量都随着死亡时间延长逐渐下降，并呈一定的线性相关。

1.2 躯体死后RNA含量的变化规律

近年来国内外对mRNA与死亡时间的相关性进行了许多研究，表明mRNA具有一定的稳定性且和死亡时间相关[12]。2005年肖俊辉等[13]利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测大鼠死后肺、胸肌β肌动蛋白（β-actin）mRNA的表达水平变化并对扩增产物进行半定量分析，发现大鼠肺β-actin mRNA于死后12d仍可检出，胸肌在8d后已无法检出，β-actin mRNA在肺脏和胸肌的稳定性呈现器官和时间差异性，可为推断死亡时间提供客观依据。2007年陈晓瑞等[14]应用复合荧光RT-PCR技术，检测大鼠死后28h内视网膜细胞β-actin、Pgk1和Rpl4 mRNA的水平，发现上述3个管家基因mRNA随着死亡时间延长而逐渐降解。2009年任广睦等[15]应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术，检测死后不同时间大鼠脑和脾脏中管家基因GAPDH mRNA及β-actin mRNA的水平，结果表明上述管家基因 mRNA的循环阈值与PMI之间存在显著的相关性。2011年王克杰等[16]研究表明小白鼠死后即刻至48h肾组织均可检测到GAPDHmRNA和β-actin mRNA，且其扩增产物呈规律性下降趋势。

以上研究从半定量到定量对RNA检测逐步深入，一致表明检测RNA含量为推断死亡时间、尤其是晚期死亡时间提供了新方法。

2 DNA和RNA含量的检测方法

2.1 DNA含量的检测方法

2.1.1 改良Feulgen染色和计算机图像分析技术

Feulgen染色是DNA特异性染色方法，其基本原理是利用酸解打断DNA分子链中的嘌呤-脱氧核糖键，暴露醛基，醛基与schiff染液反应生成无色反应物，冲洗脱硫，反应物转化为红色。应用计算机图像分析技术获得积分光密度、平均光度、平均灰度、异型指数等形态学参数，进行统计学分析，测定细胞核DNA含量，并以此推断死亡时间。王成毅等[17]研究表明脑、肝、肾组织中积分光密度和密度变化数是较好的测量参数，肺组织中异型指数、积分光密度和平均灰度是理想的测量参数，脾脏组织的灰度、色度、光密度等参数与死亡时间的相关性较好。

2.1.2 流式细胞技术（flow cytometry，FCM）

流式细胞技术是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术，能准备地进行DNA倍体分析[18]。Di Nunno等[19]应用该技术对人死后组织细胞DNA含量进行大量研究，发现该技术能准确、敏感检测到随死亡时间延长DNA含量的变化，并成功应用到实践当中。

2.1.3 单细胞凝胶电泳技术（single-cell gel eletrophoresis，SCGE）

2002年Johnson使用SCGE检测猪死后不同时间组织细胞DNA降解情况，并将该技术应用于法医学领域推断死亡时间[20]。2005年何远[21]详细报道了SCGE直接检测大鼠死后肝、脾细胞核DNA降解情况，发现尾长、尾距等参数与死亡时间高度相关，建立的回归方程对早期死亡时间的推断很有优势。

2.1.4 DNA3’末端转移法（terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT）

2005年张岚等[22]研究大鼠死后不同时间肝、肾、脾组织DNA含量变化，应用DNA3’末端转移法将dUTP结合到DNA的3’末端，检测反应剩余的dUTP量，推测DNA的降解情况。研究发现dUTP的剩余量随死亡时间延长而减少，表明该方法检测DNA含量可用于早期死亡时间的推断。

2.1.5 显微拉曼光谱技术（RAMAN）

激光共聚焦显微拉曼光谱技术是法医学领域推断死亡时间的新方法。拉曼图谱用散射特征峰的峰位和峰强来确定，不同生物组织的化学基团都有与之相应的散射特征峰，其中1 094cm-1的散射特征峰是DNA骨架磷酸基团亚磷酸离子对称振动带，代表核酸。每个散射特征峰的峰强值代表相应化学基团在组织中的含量，通过检测样本的拉曼散射特征峰，观察其峰位、峰强随死亡时间的变化，用相对峰强比值定量分析组织器官有关化学基团的变化。2011郭萍等[23]应用该技术检测离体人脾组织，发现48～72h内主要散射峰峰位无明显变化，而其峰强度有明显差异；与DNA有关的峰（1094cm-1）强度随时间推移有明显下降；各相对峰强（I1094/I2923）随死亡时间的推移而减小，该方法较好地反应了组织细胞DNA含量的变化。

2.2 RNA的定量检测方法：荧光RT-PCR

荧光标记逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术在检测mRNA推断死亡时间方面，具有灵敏度高、重复性好、自动化程度高的优点。定量PCR选用含量相对丰富、转录的RNA较稳定的管家基因作为内参照基因。2009年任广睦等[15]应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术，检测大鼠死后不同时间脑、脾等组织器官中管家基因GAPDH mRNA及β-actin mRNA时序性降解的水平，取得了良好的效果。

3 存在问题和研究前景

检测DNA降解和RNA降解的方法不同，故不能对各自的检测数据直接对比，DNA和RNA与死亡时间的相关性可以用各自的拟合方程来衡量，判定系数越接近于1，拟合方程越理想。不同组织器官死后核酸（DNA和RNA）降解存在差异，寻找理想的组织器官作为研究对象，是今后研究应当解决的问题。受诸多因素影响，单一组织器官或单一参数推断死亡时间可靠性较低，结合DNA和RNA降解规律，优选多个组织器官、多参数，将大大提高推断死亡时间的准确性和可靠性。

随着计算机技术和分子生物学检测手段的发展，其在法医学领域的应用使得死亡时间的研究深入到细胞分子水平。虽然检测核酸推断死亡时间的研究还处于实验阶段，但随着新理论的提出和新检测方法的出现，在法医学领域会有广阔的研究价值和应用前景。

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