实时荧光定量PCR检测蔬菜病原细菌技术

陈 璐 谢学文 石延霞 李宝聚

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

蔬菜细菌性病害是由植物病原细菌引起的一类病害，具有侵染途径多样、传播速度快、防治困难等特点，是蔬菜病害防治的重点。传统的病原细菌检测采用培养基分离纯化与致病性鉴定的方法，随后血清学技术的应用使得病原细菌的快速检测成为可能（Schaad & Frederick，2002）。

Rasmussen 和Wulff 于1991年首次采用PCR 方法检测植物病原菌（Rasmussen & Wulff，1991）及感染种子（Prosen et al.，1991），推动基于PCR 方法的植物病原菌检测技术快速发展。20世纪90年代中期发展起来的实时荧光定量PCR 技术可以对靶标核酸进行精确定量检测，突破了传统PCR 技术只能对目标核酸进行定性检测的局限，因而受到越来越多的重视，现已被广泛应用在植物病害诊断等不同的研究领域。近年来，多种蔬菜病原细菌的实时荧光定量PCR检测方法先后建立，为蔬菜病原细菌的研究和病害的防治提供理论依据和技术支持。

1 实时荧光定量PCR 技术原理及优点

实时荧光定量PCR 技术的原理是在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线和Ct值对未知模板进行定量分析的方法。常规PCR 中，扩增产物（扩增子）是通过终点法来分析检测，即PCR 反应结束后，DNA 通过琼脂糖凝胶电泳后进行成像分析（Klein，2002）。

相对常规PCR 而言，应用实时荧光定量PCR 方法检测植物病原菌的主要优点包括：① 实时性，实时荧光定量PCR 在反应体系中加入荧光分子，荧光信号与DNA 量的增加成对应关系，从而在反应过程中进行累积扩增产物的分析和检测；② 灵敏度高，实时荧光定量PCR 有较宽的动态范围，相较于常规PCR 而言具有较高的检测灵敏度；③ 反应封闭，由于PCR 反应和检测均在反应管中进行，大大降低了样品的污染和假阳性的机率；④ 操作简易，实时荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，节省了试验时间，提高了试验效率；⑤ 特异性强，不受植物症状的限制，能快速准确检测到植物病原菌；⑥ 高处理量，自动化的PCR检测系统具有较高的处理量，为大规模的植物病害诊断提供新的思路。

2 实时荧光定量PCR 在几种重要蔬菜病原细菌检测方面的应用

2.1 假单胞菌属（Pseudomonas）实时荧光定量PCR检测技术

植物病原假单胞菌（Pseudomonas）导致许多植物病害，如黄瓜细菌性角斑病（Pseudomonas syringapv.lachryman）、番茄细菌性斑点病（P.syringaepv.tomato）、平菇褐斑病（P.tolaasii）、莴苣软腐病（P.cichorii）、莴苣褐腐病（P.marginalispv.marginalis）等（Schaad et al.，2001）。实时荧光定量PCR可用来对寄主植物组织内潜伏侵染的病原菌或对种植环境中潜伏侵染的病原菌进行定量检测。如：菊苣假单胞菌（P.cichori）对结球期的莴苣造成侵染并引起典型的软腐病症状的浓度为100 cfu·mL-1，Cottyn 和Baeyen（2011）基于hrcRST致病基因片段建立了一种灵敏的实时荧光定量PCR检测灌溉水中菊苣假单胞菌的方法，检测灌溉水中菊苣假单胞菌的灵敏度为1 cfu·mL-1，远远低于该病害的发病阈值，从而为莴苣软腐病的早期预测和预警提供信息。

多重实时荧光定量PCR 技术可以特异性检测多种病原菌，如基于丁香假单胞菌属（P.syringae）细胞色素氧化酶辅酶基因序列差异建立的实时荧光定量PCR 技术，可以特异检测8种丁香假单胞菌致病变种病原菌（syringae，tomato，maculicola，tabaci，atropurpurea，phaseolicola，pisi，glycinea），检测灵敏度为100 fg，即4.5×103cfu·mL-1，提高了检测效率，并可以直接定量接种丁香假单胞菌番茄致病变种（P.syringaepv.tomato）的番茄离体叶片中病原菌DNA 的含量（Xu & Tambong，2011）。

2.2 黄单胞菌属（Xanthomonas）实时荧光定量PCR检测技术

黄单胞菌属（Xanthomonas）是薄壁菌门的一个成员，革兰阴性菌，该属的细菌成员都是植物病原菌，可以危害120 多种单子叶植物和270 多种双子叶植物，引起许多重要的植物病害，导致植物叶枯、坏死、萎蔫等症状；模式种是野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris），俗称甘蓝黑腐病菌。该病原菌寄主广泛，几乎可侵染十字花科的全部植物，引起十字花科黑腐病，叶片边缘形成典型的V 字形黄褐色病斑，是危害十字花科植物的一种重要病原菌。相对于普通PCR，实时荧光定量PCR 的高灵敏性使得诸如十字花科黑腐病等种传细菌性病害的研究有所突破。Berg 等（2006）建立了芸薹属蔬菜多种野油菜黄单胞菌（X.campestris）的致病变种（Campestris，aberrans，Armoraciae，Raphani）带菌种子的高灵敏性实时荧光定量PCR，该方法可以检测到10 000个种子中的1个带菌种子，比常规PCR 灵敏度高100倍，可快速检测以上几种野油菜黄单胞菌的菌落、十字花科蔬菜的带菌种子和带菌植株中的病原菌，为种植户和种业商户提供防治黑腐病的可靠方法。实时荧光定量PCR 还可以通过测定寄主植物受侵染时基因的变化来研究寄主对病原菌的抗病分子机制。如在花椰菜对甘蓝黑腐病菌抗病分子机制的研究中，应用实时荧光定量PCR 技术对所构建的cDNA 文库中相应的12个不同功能的基因表达谱进行表达量的监测，从而得到花椰菜中参与甘蓝黑腐病抗病分子机制的相关基因（Jiang et al.，2011）。

2.3 欧文氏菌属（Erwinia）实时荧光定量PCR检测技术

欧文氏菌属（Erwinia）是人类最先发现的植物病原细菌，由欧文氏菌引起的细菌性软腐病在世界各地都有广泛发生和报道。主要症状是果实或叶片基部变软、腐烂、伴有恶臭，可以是生长期病害，也可以是贮藏期病害。

欧文氏菌属主要引起瓜类细菌性枯萎病（E.tracheiphila），马铃薯、萝卜、大白菜等蔬菜的软腐病（E.carotovara）。Atallah 和Stevenson（2006）利用实时定量PCR 技术检测了5种马铃薯病原菌（E.carotovorasubsp.carotovoraand subsp.Atroseptica、Phytophthora infestans、Phytophthora erythroseptica、Pythium ultimum、Fusarium sambucinum），检测的灵敏度达到0.5 pg，可直接从商业马铃薯块茎提取液中检测到1 ng 的马铃薯软腐病菌（E.carotovora），为马铃薯采收后的商业贮存能力预测提供方法。

2.4 其他重要细菌性病害实时荧光定量PCR检测技术

应用实时荧光定量PCR 技术检测其他蔬菜重要病原细菌也有较多相关报道，其中研究最为深入的是瓜类细菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli）。该病原之前被命名为嗜酸菌燕麦种西瓜亚种（Acidovora avenaesubsp.Citrulli）。燕麦嗜酸菌属病原菌的保守序列较易寻找（Schaad &Frederick，2002），故经典的实时荧光定量PCR检测体系基于ITS 等保守序列设计相关的PCR引物（Schaad et al.，2000）。近年来，随着免疫学和选择性培养基等富集方联合实时荧光定量PCR 技术检测病原菌日渐成熟，定量PCR 的灵敏度得到进一步提高。应用免疫学方法，如磁珠捕获法与实时荧光定量PCR 技术相结合，检测瓜类果斑病菌灵敏度可达到10 cfu·mL-1，病种的检出率为0.02%，较单一实时荧光PCR检测的灵敏度提高了10倍（Ha et al.，2009）。利用选择性培养基，如应用EBB 和EBBA 培养果斑病菌，结合实时荧光定量PCR 方法检测果斑病菌，病种的检出率为0.1%（Zhao et al.，2009），可以在一定程度上排除杂菌的影响，进一步提高检测的灵敏性，具有较好的应用前景。

青枯病是重要的植物病原细菌，影响多种农作物，控制青枯病重要的是早期的检测和预防。利用免疫磁珠分离（IMS）和磁珠捕获杂交（MCH）的方法，纯化马铃薯青枯病菌（Ralstonia solanacearum）R3Bv2株系的细胞和DNA，与实时荧光定量PCR 技术相结合，可将实时荧光定量PCR检测方法1 000 cfu·mL-1的检测阈值提高到 500 cfu·mL-1（Ha et al.，2012）。Weller等（2000）首次利用实时荧光定量PCR 方法检测马铃薯块茎提取液中的青枯菌，检测的阈值只能达到1×105～1×106cfu·mL-1。对于青枯病菌等土传细菌性病害，实时荧光定量PCR可以直接检测土壤样本中的微量目标病原菌的量，而省去了病原菌的分离培养。Chen 等（2010）建立了单基因实时荧光定量PCR 扩增方法，对番茄病组织和种植环境土壤中的青枯病菌直接检测限能达到100 cfu·g-1，而采用普通PCR 方法对茄子青枯病的根围土壤进行检测的最低检测阈值是400 cfu·g-1（Ramesh et al.，2011）。

番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensissubsp.Michiganensis）可以在番茄种子间传播而导致严重的经济损失。利用MCH 方法纯化番茄溃疡病病原菌核酸，解除病组织和土壤溶液中PCR 反应抑制物的影响，可以使多重实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度达到105cfu·mL-1（Johnson & Walcott，2012）。Cho 等（2012）建立了检测番茄和红辣椒上溃疡病菌（C.michiganensissubsp.michiganensis）的定量PCR 方法，该方法可检测到该病原菌的单克隆，灵敏性进一步提高，可应用于该病原菌低浓度带菌种子的检测，为该病害的潜在威胁提供预警。

3 展望

实时荧光定量PCR检测方法快速、灵敏且特异性强，已被广泛应用于植物细菌性、真菌性以及病毒性病原的检测。蔬菜病原细菌多为种传，少量甚至微量的病原菌在合适的气候条件下能够很快地传播，导致严重的病害流行，故高灵敏性的实时荧光定量PCR 对带菌种子的检测技术尤为重要。随着蔬菜产量的连年升高，蔬菜细菌性病害的大规模检测也越来越受到重视，自动化的荧光PCR检测系统具有较高的处理量，为多种病原菌的同时检测提供基础。另外，虽然实时荧光定量PCR 还处于初级阶段，但其对于mRNA 的定量检测有较大的潜力，可以用于病原菌与寄主间的互作或病原菌对环境变化响应的研究。同样，实时荧光定量PCR 为单核苷酸多态性（SNPs）的研究提供了可靠的方法，可用于特定病原菌基因群体的研究（Schena et al.，2004）。然而，在蔬菜病原细菌的检测应用中，相比普通PCR 而言，其可用的荧光引物和探针仍然受到限制，且染料和探针的价格较为昂贵；而实时荧光定量PCR 最大的局限在于依然无法区分检测材料的死活，而自然条件下的核酸酶在很多情况下不能完全降解死亡细胞。虽然选择性培养基联合实时荧光定量PCR 的方法可以定量检测存活细胞，但其周期较长（细菌培养耗时1～4 d），快速有效鉴定植物病原菌死活及检测病原菌总量的方法尚未建立。随着技术的发展、试验材料成本的降低以及技术之间交叉利用的快速发展，实时荧光定量PCR 在蔬菜病原细菌检测方面将有更广泛更深入的应用前景。

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