无创产前基因诊断方法研究进展

曾 婷综述 熊礼宽审校

深圳市宝安区妇幼保健院中心实验室(518133)

产前诊断又称宫内诊断，是指在胎儿出生前，通过影像学、生物化学、细胞遗传学以及分子生物学等技术，了解胎儿宫内的发育状态，对先天性缺陷或遗传性疾病作出诊断。产前诊断是预防严重遗传性疾病或先天性缺陷胎儿出生的一项有效而可靠的措施，是优生和提高人口质量的重要保障之一。产前诊断方法根据采样途径或诊断方法是否构成对胎儿的影响可分为创伤性和无创性。前者主要包括羊膜腔穿刺、绒毛取样、脐血取样、胎儿镜和胚胎活检等，虽然诊断精确度较高，但可导致流产或感染等并发症，常在高危孕妇中实施;后者包括超声波检查、直接从母体外周血中获取胎儿细胞、胎儿游离DNA［1］或游离RNA检测，该法既能行产前诊断又无危险性，尽早发现和杜绝异常胎儿，亦适用于大群体筛查，达到优生目的。近年来，胎儿游离核酸和有核细胞结合基因检测取得较大进展，本文就无创产前基因诊断的研究材料、方法学及其产前诊断中的应用进行综述。

1 无创产前诊断的研究材料

1.1 孕妇外周血中循环的胎儿细胞

许多研究表明，循环于孕妇外周血中的胎儿细胞主要有胎儿滋养层细胞、胎儿淋巴细胞和胎儿有核红细胞。由于滋养层细胞存在胎盘局限性嵌合体现象，胎儿淋巴细胞可在生产后的母体外周血中存活达27年之久，因此，极大地限制了这两类细胞用于无创产前诊断的应用。近年来，许多研究集中在胎儿的有核红细胞方面，被认为是最佳的无创产前诊断实验的细胞来源。其主要优势有:①含有完整的胎儿基因组DNA;②细胞生命周期短，不受多次妊娠干扰;③健康非孕妇的外周血中十分罕见;④可根据特异的细胞标志物，如 HbF(γ 链)、CD71［2］等区别于母体外周血中的其他细胞。

目前常用于从孕妇外周血中分离富集胎儿有核红细胞的方法有:流式细胞仪分离技术、磁激活细胞分选法、密度梯度离心法、单细胞显微操作分离法、亲和素分离法、微流控制分离法等［3］。

1.2 孕妇外周血中存在的胎儿游离DNA(cff DNA)

1997年，Lo等［1］发现母体外周血浆中存在cff DNA，随孕龄增长稳定存在，在孕妇分娩后快速消失，可以作为无创产前诊断的理想材料。由于cff DNA在母体外周血浆总DNA中所占比例较低(3%～6%)，cff DNA的提取纯化方法尤为关键。2004年，Chan等［4］研究发现，非孕妇的外周血浆中的游离DNA分子片段长度比孕妇DNA短。进一步研究发现，胎儿的游离DNA分子片段长度＜313 bp，其中80%不足193 bp，而其母体的游离DNA分子片段长度＞201 bp，这个现象为分离cff DNA提供了保证。cff DNA可结合二代测序应用于临床筛查21三体、18三体和13三体综合征。虽然目前cff DNA的提取纯化方法尚未标准化，但其用于筛查的敏感性和特异性明显高于生化标记物，包括母体血清妊娠相关蛋白A(PAPP-A)、游离β绒毛膜促性腺激素(β -hCG)、甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(μE3)和抑制素A(inhibin A)。目前常用的鉴定cff DNA的技术有:实时定量 PCR［5］、巢式 PCR、焦磷酸解激活的聚合 PCR［6］、数字化 PCR［7］以及质谱分析。

1.3 孕妇外周血中存在的胎儿游离miRNA

miRNA为一类单链非编码小分子RNA，长度约为19～25个核苷酸，在基因转录后，通过与靶mRNA相结合，抑制mRNA的翻译或降解mRNA，从而达到对人类基因表达的调控作用。2008年Chim等［8］发现孕妇外周血中存在胎盘游离miRNA，分娩24h后即检测不到表达。一些miRNA如miR141和miR149的表达量可随孕龄增长而升高，且与胎盘的大小相关联。进一步研究发现在孕妇外周血中存在许多与胎儿相关的miRNA［9］，可用于胎儿诊断，为无创产前诊断研究开辟了另一途径。

2 基因诊断方法在产前诊断中的应用

2.1 全基因组扩增技术(WGA)

WGA是一种对全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增的技术，可以在保持基因组原貌的基础上最大限度地增加基因组DNA的量。该技术可对痕量DNA(检测灵敏度可达5pg)进行扩增，为后续的基因组分析提供足量的模板。常用的WGA主要分两类:一类是以PCR为基础，如使用变性寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、引物延伸预扩增PCR(PEP-PCR);另一类是不以PCR为基础，如多重置换扩增(MDA)。由于以PCR为基础的WGA易产生非特异性的扩增，位点覆盖率不完全，且DNA片段长度一般小于1kb，使其应用受到限制［10］。

MDA的出现，使真正意义的全基因组扩增得以实现。该技术能提供高度均一完整的全基因组序列，确保最低的位点扩增误差，使产物与模板的遗传序列信息保持一致。MDA是一种等温的链置换扩增反应，其使用随机6个碱基引物在多位点与模板结合，采用很强的模板结合和置换能力的phi29DNA聚合酶实现对全基因组的扩增。MDA具有如下优点:①能产生大量高质量的DNA产物;②能扩增出集中均一的长片段产物，便于后续分析;③能使基因组DNA均匀扩增，且扩增偏差小。由于MDA能高保真地复制全基因序列，使得体外扩增胎儿有核红细胞基因组成为可能。2007年，刘维瑜等［11］用显微操作法获取孕妇外周血循环的单个胎儿有核红细胞后，进行MDA，得到的全基因组扩增产物直接作为模板进行性别鉴定及短串联重复序列连锁分析检测，验证有核红细胞的来源，同时进行杜氏肌营养不良的无创产前基因诊断，诊断结果与引产或产后反馈相一致。今后，结合MDA技术，将会加快孕妇外周血中循环的胎儿有核红细胞在无创产前诊断应用的脚步。

2.2 比较基因组杂交(CGH)

该技术基本原理是分别用不同的荧光标记体系标记来自待检组织和正常组织的全基因组DNA(分别称为测试DNA和参照DNA)，各取等量标记产物制备成混合探针，与足够量的同一种属来源的Cot.I DNA先进行预杂交以封闭基因组上的重复序列，然后与正常中期分裂相进行染色体原位杂交。测试DNA探针和参照DNA探针竞争性地与染色体上的靶序列杂交，经计算机软件分析，将染色体上每一像素上测试DNA/参照DNA荧光强度的差异进行计算，以研究测试DNA拷贝数的增多或缺失。该技术不需细胞培养，一次杂交实验即可在整条染色体或染色体区带水平对不同基因组间DNA序列拷贝数的差异进行检测并定位。为了解决传统的CGH杂交时间太长，研究人员将基因芯片和CGH结合，形成新技术-微阵列比较基因组杂交技术(microarray-CGH，又称arrayCGH)。其原理与CGH相似，不同之处是用微阵列(即基因芯片)代替了中期分裂相，荧光标记的测试DNA探针和参照DNA探针竞争性地与微阵列中的短片段靶序列杂交，这样就缩短了检测时间，达到灵敏、快速、自动化，在临床遗传学诊断中有较好的应用前景。

比较传统染色体核型分析技术，arrayCGH技术的优点在于可检测基因组上的微缺失和微重复。而且由于不需要细胞培养和细胞分离，可直接取材于羊水细胞、绒毛细胞或脐血。Hillman等［12］为了评价arrayCGH在微观基因组失衡的产前筛查临床价值，特设计了一组实验进行研究，2008～2011年，共收集了3 171份胚胎均进行过产前arrayCGH检测和传统染色体核型分析检测，结果显示arrayCGH方法检测微观基因组失衡是有效的。

在个案研究中，研究人员利用arrayCGH发现了许多新缺失，如带有12q22q23.2间隙式缺失的畸形胚胎［13］、新12p-三体综合征［14］以及带有15 q15.3-q21.3间隙式缺失的短股骨分离畸形胚胎［15］。Gruchy等［16］收集了38例高危孕妇(其中某些存在胎儿宫内发育迟缓和/或胎儿畸形)已细胞培养过的羊水细胞DNA和羊水cff DNA进行arrayCGH诊断，结果显示直接提取于羊水的cff DNA得到了很好的结果(8%的畸形确诊率，同时也经传统核型分析验证过)。已培养的羊水细胞DNA，直接提取cff DNA的优势在于可在妊娠晚期进行，而羊水细胞培养则不行。

2.3 二代测序技术(NGS)

NGS为新一代测序技术［17～19］，其主要原理是:①每个位点以单分子原DNA模板合成新DNA同时测序，在此过程中添加不同种dNTP会释放出不同的荧光;②巨大数量位点上各DNA短片段测序以阵列方式同时平行进行。通过测定每种分子序列的频率定量地反应其在原DNA库中的频率，同时测出的序列准确、定性地反应其在原DNA库中的序列，如有背景信号造成序列不符很容易在结果中滤除。这一测序技术不仅保持了高准确度，而且在明显提高测序速度，同时极大降低了测序成本，为未来更全面、更深入地对疾病进行研究提供平台，使得从基因组水平、转录组水平和蛋白质组水平对疾病展开全方位研究成为可能。

由于二代高通量测序的高效性及高准确率，研究人员将其作为无创产前基因检测技术，直接取材于孕妇外周血中存在的cff DNA，应用于胎儿染色体非整倍体的临床检测。Chiu等人［20］提取了753例孕妇的外周血cff核酸，并用二代测序技术进行测序，准确诊断出86例孕妇怀有21三体的胎儿。21三体的阳性预测率为96.6%，阴性预测率为100%，灵敏度达到100%，特异性达到97.9%。Palomaki等［21］用染色体核型分析方法和二代测序方法分别对212例已证实怀有21三体胎儿的孕妇和1 484例正常孕妇进行cff核酸检测。结果显示，21三体的检出率为98.6%，假阳性率仅为0.2%。除了检测21三体以外，这项技术还可用于鉴定18三体和13 三体，检出率高达100%和91.7%［22］。Dan等［23］募集到11 105例孕妇，利用二代测序进行了胎儿21三体和18三体综合征的检测，结果共检测出190例(1.17%)染色体数目异常患者，包括143例21三体综合征患者以及47例18三体综合征患者。通过对阳性结果进行核型分析以及胎儿出生后的随访，研究人员发现所检测出的21三体和18三体综合征病例中均有一例假阳性;而在对所有的阴性病例及胎儿出生后的随访中发现没有出现假阴性。因此，本次临床结果显示二代测序无创产前基因检测技术的敏感度达到100%，准确度达到99.96%。

3 展望

综上所述，随着分子生物学和细胞生物学等技术的发展与完善，使得从孕妇外周血中分离并检测胎儿细胞和cff核酸成为可能。目前虽然有些分离胎儿细胞的方法相对简便，但由于其分离效率低使得应用受限制，将来若能结合WGA，以获得大量高质量的DNA产物，这一问题将得以解决。由于孕妇外周血中cff核酸受母体核酸物质的干扰，检测技术难度大，其应用受到限制。随着表观遗传学的发展，利用母亲与胎儿的DNA甲基化的差异性，例如18号染色体上的mapsin基因、3号染色体上的rassf1a基因、21号染色体上的 aire、erg和 hlcs基因［24］以及DSCR4基因［25］就可区分母体核酸，排除其干扰。目前无创产前诊断技术相对较复杂，且成本高，在现有技术水平上难以大范围应用于临床实验室诊断。随着科学的发展，会使这些技术操作简化、标准化，提高诊断准确率，降低成本。总之，无创产前基因诊断替代传统的产前诊断是未来发展的必然趋势。

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