再生障碍性贫血小鼠造模方法

邢海燕 胡春萍 蔡雪婷 胡灿红 曹 鹏 王志刚 (江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028)

再生障碍性贫血小鼠造模方法

邢海燕 胡春萍 蔡雪婷 胡灿红 曹 鹏 王志刚 (江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028)

目的 探讨再生障碍性贫血(AA)小鼠造模方法。方法 三次造模分别采用:免疫介导法:小鼠经6.0 Gy60Coγ射线亚致死量全身照射后，由尾静脉输入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴结混合细胞悬液1×106个细胞/0.2 ml/只。混合方法:小鼠一次全身3.0 Gy60Coγ射线照射后，分别在第4、5、6天腹腔注射环磷酰胺50.0 mg/kg及氯霉素62.5 mg/kg。化学方法:用苯+玉米油，背部皮下注射，3次/w，共注射15次。同时腹腔注射环磷酰胺溶液(50 mg/kg)，每日1次共7次。结果 免疫介导法造模后模型小鼠在15 d内除1只小鼠外全部死亡;混合方法造模，模型小鼠骨髓活检提示造模失败;化学方法造模，造模成功，模型维持时间长。结论 免疫介导和混合方法造模速度快，对模型小鼠骨髓抑制明显，与临床急性AA接近;化学方法造模周期长，模型小鼠骨髓抑制较轻，与临床慢性AA接近。

免疫介导;混合方法;化学方法;再生障碍性贫血

再生障碍性贫血(AA)患者多为青壮年，急性病例预后极差，仅慢性轻型病例有望获得缓解或治愈。近年来人们为了探讨AA的发病机制及筛选有效的治疗药物，做了很多的研究和探讨，而研究的深入有赖于良好的AA动物模型的建立。为此，笔者曾经在研究AA的药物治疗中，曾先后三次建立AA小鼠模型，本文拟探讨一种方法简便、成功率高、维持时间较长，与人类病理改变相似的AA小鼠模型的建立方法。

1 材料与方法

1.1 方法一

1.1.1 实验动物 近交系 Balb/c小鼠45只，全雌，体重(18±2)g，DBA/2小鼠2只，全雌，体重(18±2)g，作为细胞供者。两者均由上海市西普尔-必凯实验动物有限公司提供，合格证号SCXK(沪)2008-0016。

1.1.2 胸腺淋巴结细胞悬液制备 将两只DBA/2小鼠断颈处死，95%酒精浸泡消毒5 min后，无菌取出胸腺及颈、腋下、腹股沟等处的淋巴结，加磷酸盐(PBS)缓冲液，除去表面血污及黏附的结缔组织。再次清洗后，用手术刀、剪刀反复剪切组织，研磨直到成糊状，再经尼龙滤血网过滤，使之成为单细胞悬液。计数后配成1×106/ml浓度备用。

1.1.3 AA模型建立 取正常BALB/C小鼠45只，随机取其中5只作为正常对照组，其余40只参照姚军等〔1〕方法:将Balb/c小鼠40只经6.0 Gy60Coγ射线亚致死量全身3 min照射后，4 h内由尾静脉输入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴结混合细胞悬液0.2 ml，输注细胞数为1×106/0.2 m l/只。

1.2 方法二:

1.2.1 实验动物 ICR小鼠20只，全雄，体重(18±2)g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号:SCXK(沪)2007-0005。

1.2.2 实验试剂 氯霉素(cH)陕西省西安妇幼制药厂生产，批号:990617;环磷酰胺(CY)上海华联制药厂有限公司生产，批号:990406。

1.2.3 AA模型建立 20只小鼠一次全身3.0 Gy60Coγ射线照射(剂量率1.353 1 Gy/min，距离170 cm，照射时间2 min 13 s)。照射后第4、5、6天时腹腔注射环磷酰胺50.0 mg/kg及氯霉素62.5 mg/kg。

1.3 方法三

1.3.1 实验动物 ICR小鼠50只，全雄，体重(18±2)g，由上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号:SCXK(沪)2007-0005。

1.3.2 AA模型建立 50只小鼠分为对照组10只:玉米油，2 ml/kg。背部皮下注射，3次/w(周一，周三，周五)，总共注射35 d。腹腔注射同体积生理盐水，1次/d，共7次。造模组40只:苯 +玉米油(1∶1配制)，2 ml/kg(1 ml苯 +1 ml玉米油)，背部皮下注射，3次/w(周一，周三，周五)，总共注射15次。同时腹腔注射环磷酰胺溶液50 mg/kg(产品批号:11061421，江苏恒瑞医药股份有限公司)。1次/d，共7次。造模持续35 d。

2 结果

2.1 方法一造模结果 给药4 d后，造模组小鼠逐渐出现精神萎糜、大汗、皮毛稀疏、枯槁、体重明显下降，在造模后的15 d内除1只小鼠外全部死亡。这与文献报道的相吻合〔1〕。

2.2 方法二造模结果 造模结束后2 d，处死小鼠后，取小鼠股骨的长骨干及干骺端，甲醛溶液浸泡固定后，脱钙，切片，然后HE染色后观察骨髓切片病理，低倍镜观察组织结构:骨髓造血组织增生活跃，干骺端造血组织约占60%，骨干处增生度约为90%，可见三系各阶段造血细胞，分布未见明显异常。

2.3 方法三造模结果 造模结束后2 d，取小鼠眶静脉血，用全自动血细胞分析仪计数做血常规计数，了解各组小鼠血常规变化。模型小鼠外周血及骨髓液流式细胞仪检测结果，较正常组有明显变化，显示造模成功，且模型维持时间长。

3 讨论

AA小鼠的造模方法有很多种，包括物理，化学，免疫介导及混合方法等，各种方法各有其特点。物理方法多以γ射线、x射线等以致死量或亚致死量照射;化学方法中常用的药物有白消安(马利兰)、环磷酰胺、氯霉素、苯剂等。Muir等〔2〕发现单纯采用放射线造模各系细胞下降较为明显，维持周期较长，但其射线还会损伤全身各器官，毒副作用大，照射剂量亦不容易掌握。陈俊等〔3〕研究发现，单纯照射后第5天骨髓干细胞数处于极低水平，但第9天起造血干细胞开始明显增加。似乎结论有相互矛盾之处。化学药物中，有研究发现利用白消安制造的AA动物模型，易使骨髓出现永久性损伤，而不符合造模的要求;张擎等〔4〕以环磷酰胺大剂量冲击建立免疫紊乱动物模型，实验动物虽有外周血常规一过性减低，但停药后迅速回升;Lezama〔5〕单纯用苯(加玉米油)诱发的小鼠再障模型，方法简单，维持时间长，但诱导时间长达45 d。目前应用较多的模型是免疫介导的模型，即将DBA/2小鼠的胸腺淋巴结细胞(供体)输注给受亚致死量照射的Balb/c小鼠(受体)体内，建立免疫介导AA模型。但免疫介导模型的建立实验操作复杂，要求条件高，往往需要专业人员进行，且动物模型死亡快，有报道造模后第14天除1例外全部死亡〔1〕。

笔者先后三次造模，采用的分别是免疫介导、混合方法及化学方法，均根据相关文献报道，由相关专业技术人员严格操作完成。第一次免疫介导法造模，因模型小鼠死亡快，不能满足实验药物疗效观察的要求;第二次混合方法造模，骨髓活检提示造模失败，考虑与小鼠射线照射的剂量没有很好把控有关;第三次化学方法造模，外周血中白细胞、红细胞下降明显，血小板无明显改变，免疫T细胞及亚群中CD4+、CD4+/CD8+及CTLA-4+/CD28+的变化有统计学差异，其他虽有改变但无统计学差异，其中CD8+T细胞数、CD28+等指标的变化与文献报道不符。

姚军等〔1〕认为照射和淋巴细胞的输入是造模两个必需的条件，且要求两者达一定剂量，任何单独一个都不能引起造血衰竭。通过照射不仅降低了造血干细胞的数量，引起骨髓储备力下降，而且削弱了宿主的免疫功能，使得输入的淋巴细胞得以生存下来，通过某些途径对宿主造血系统产生抑制。Chiu等〔6〕研究提示再障的发生是在骨髓造血干细胞数量减少到一定阈值的前提下继发于输入免疫活性细胞所致的免疫反应。陈俊等〔3〕实验研究提示AA小鼠中存在抑制正常造血细胞的细胞，推测它们可能属于T细胞，它们究竟是来源于供者小鼠的细胞，还是来源于受体小鼠本身细胞仍不清楚。而单纯用苯、氯霉素、环磷酰胺等化学药物造模的方法，操作简便，易于控制。环磷酰胺是一种免疫抑制剂，苯对骨髓的毒性不在于苯本身而在于苯的有毒代谢产物--氢醌、苯醌等。氢醌通过抑制核因子-κB的活化而使造血前体细胞对细胞因子诱导的凋亡敏感性增高，从而产生造血抑制〔7〕。苯醌可以通过与DNA共价结合形成DNA加合物，增加了DNA的不稳定性，导致DNA损伤〔8〕。氯霉素有学者〔9，10〕认为在遗传敏感的个体中，能直接损伤细胞DNA，造成骨髓造血干细胞和微环境的缺陷，从而导致骨髓造血衰竭。

笔者认为，AA分为急性、慢性AA，预后有明显差异，故在发病机制上两者有所不同。免疫介导和混合方法形成的AA模型，造模速度快，外周血象及骨髓组织中造血细胞减少明显，肝、脾的损伤、组织坏死明显，与临床上急性AA比较接近;而单纯化学药物联合造模，造模周期较长，骨髓抑制情况较轻，肝、脾的变化以体积和重量的减少为主，组织坏死不明显〔4〕，造模小鼠存活时间长，且模型维持时间长，与慢性AA情况比较符合，能满足实验药效的观察要求。所以，AA小鼠模型的建立方法，可以根据实验目的的不同，加以选择。

1 姚 军，李树浓.淋巴细胞与再生障碍性贫血关系的实验研究〔J〕.中华血液学杂志，1991;12(5):229-31.

2 Muir KR，Chilvers CE，HarAss C.The role of occupational and environmental exposures in the aetiology of acquired severe aplastic anaemia:a case control investigation〔J〕.Br JHaematol，2003;123(5):906-14.

3 陈 俊，赵 波，李树浓，等.免疫诱导再障小鼠骨髓造血干细胞的改变及机理〔J〕.中山医科大学学报，1991;12(1):32-5.

4 张 擎，彭红娟，徐晓彬，等.环磷酰胺诱发小鼠血小板减少症模型的建立及其血小板功能的测定〔J〕.第一军医大学学报，2003;23:12.

5 Lezama RU.A model for the induction of aplastic anemia by subcutaneous administration of benzene in mice〔J〕.Toxicology，2001;162:179-91.

6 Chiu KM，Knosp WH.Immunologically mediated aplastic anemia in mice:effects of varying the source and composition of donor cells〔J〕.Exp Hematol，1987;15:269.

7 Kerzic PJ，Pyatt DW，Zheng JH，et al.Inhibition of NF-kappaB by hydroquinone sensitizes human bonemarrows progenitor cells to TNF-α1 Phainduced apoptosis〔J〕.Toxicology，2003;187:127-37.

8 Levay G，BodellWJ.Potentiation of DNA adduct formation in HL60 cells by combination of benzene metabolites〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1992;89:7105-9.

9 DaWM.In vitro studies on the pathogenesis of aplastic anemia in Chinese patients〔J〕.Exp Hematol，1988;16:336-9.

10 Abdou NI，Verdirame JD，Amare M，et al.Heterogeneity of pathogenetic mechanisms in aplastic anemia〔J〕.Ann Inter Med，1981;95:43-50.

R55

A

1005-9202(2013)23-5888-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.23.051

江苏省中医药科技项目立项计划(LB09060)

邢海燕(1971-)，女，硕士，副主任医师，主要从事中西医结合治疗肿瘤、血液病研究。

〔2012-04-17收稿 2012-09-10修回〕

(编辑 曹梦园)