烟草类胡萝卜素代谢的遗传及基因工程研究进展

杨永霞，冯琦,王景，崔红，刘国顺

烟草行业栽培重点实验室 河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95号 450002

植物中的类胡萝卜素是生物体内通过类异戊二烯途径合成，主要是含有40个碳原子的萜类色素物质。类胡萝卜素在光合作用中担负着光吸收辅助色素的重要功能，起着提高光合效率、保护光合器官、防止光氧化损伤等的重要作用[1-2]。类胡萝卜素类物质包含很多具有鲜艳色彩的色素物质，可以赋予植物花和果实等器官绚丽的色彩，在植物长期的进化和发育过程中具有重要作用。此外，植物类胡萝卜素还是许多生理活性物质，如植物激素(ABA，独脚金内酯等)、防御化合物和风味芳香物等生物合成的前体[3-6]，因此，研究类胡萝卜素具有重要的现实意义。关于植物类胡萝卜素的生物合成及其遗传操作已有详细综述[7]，本文对烟草有关的合成及遗传调控做简单介绍，重点对烟草类胡萝卜素降解途径进行详细综述。

1 类胡萝卜素的代谢途径

1.1 类胡萝卜素的生物合成

过去的若干年里，对于植物类胡萝卜素的生物合成已经有较深入的研究。与编码绿色植物类胡萝卜素生物合成相关酶类的基因和cDNA都已经进行了鉴定或测序[8]，编码的蛋白质等产物的特性也进行了相关分析，这为基因工程改良作物中类胡萝卜素的种类及含量奠定了重要基础。烟草中存在的类胡萝卜素主要有八氢番茄红素、叶黄素、a，β-胡萝卜素、新叶黄素和叶红素等。烟草中类胡萝卜素在质体中合成，其前体物质异戊烯焦磷酸(IPP)通过3-磷酸甘油醛/丙酮酸途径合成类胡萝卜素，其生物合成主要是先合成前体物 IPP在异戊烯基焦磷酸异构酶( isopentenyl pyrophosphate isomerase，IPI) 催化下生成其异构体异戊二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，IPP可与DMAPP缩合形成牻牛儿基焦磷酸，在牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GPPS)催化下再与2个IPP合成牻牛儿牻牛儿基焦磷酸(GGPP)，GGPP是植物多种物质生物合成的共同前体。然后2分子的GGPP由八氢番茄红素合成酶((phytoene synthase, PSY)催化形成无色的八氢番茄红素。后者在八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase, PDS)和ζ-胡萝卜素脱氢酶 (ζ-carotene desaturase, ZDS)的作用下形成红色的番茄红素。番茄红素经番茄红素β-环化酶 (lycopene-β-cyclase, LCYB)和番茄红素 ε-环化酶(lycopene-ε-cyclase, LCYE)催化环化，形成2个β环的β-胡萝卜素和α-胡萝卜素，这是类胡萝卜素合成途径中的关键分支点。α-胡萝卜素在类胡萝卜素异构酶(carotenoid isomerase, crtISO)的作用下结构发生异构化最终形成叶黄素。β-胡萝卜素在β-环羟化酶(carotene hydroxylase, crtRB)的作用下羟基化反应形成玉米黄素。再经玉米黄素环氧酶(zeaxanthin epoxidase, ZEP)催化形成堇菜黄素。类胡萝卜素代谢途径中涉及的基因和酶很多，其中，IPI、GPPS、PSY 和PDS等都是类胡萝卜素合成途径重要的关键限速酶[8]。已发现，IPI和PSY的过量表达会导致类胡萝卜素含量的增加[9]。Livingstone等对番茄、辣椒以及柑橘等6个物种的PSY、ZDS、LYCB以及ZEP序列进行分子进化比较分析发现，PSY、ZDS和LYCB所受的选择压力类似，尤以LYCB的同义替换速率最高；而ZEP的非同义替换速率最高[10]。说明类胡萝卜素合成途径中上游的基因处于强烈的选择压力限制之下，进化速率较慢，下游的基因处于放松的选择压之下，进化速率更快。

1.2 类胡萝卜素的降解

烟草类胡萝卜素是烟叶重要致香物质的前体物，其降解产物的种类及含量直接决定着烟叶以及烟草类食用香精香料的品质[11]。因此，目前对烟草类胡萝卜素研究的焦点集中在烟草致香物质上面。在烟叶总挥发性香气成分中，类胡萝卜素降解产生的茄酮和β-大马酮等香味物质刺激性较小，香气质较好，对烟叶香气贡献率大，是影响烟叶香气质和香气量的重要组分。同时，类胡萝卜素具有提高光合效率、抑制和清除自由基的作用[1]，对改善烟叶品质和降低烟气自由基伤害也具有重要意义。因此，在卷烟产品开发以及烟草类香精香料提取工业中，类胡萝卜素及其降解产物的种类和含量，是卷烟配方设计和烟叶原料调香配方形成香气风格的重要化学组分，也是今后烤烟生产和研究中需加以重点关注的指标。

相对于类胡萝卜素的生物合成，类胡萝卜素的降解过程，研究却相对较少。类胡萝卜素的降解可能主要是由光敏氧化作用引起，降解过程是否由酶催化、其具体的生化机制等问题，还有待进行深入研究。目前，对于氮磷钾肥及水分因子对烤烟叶片类胡萝卜素类物质叶黄素的综合影响[12]，烤烟成熟过程中类胡萝卜素变化与其降解香气物质的关系[13]，以及脂氧合酶(LOX)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)对类胡萝卜素降解的生理影响已有研究[14]。但是，对于参与类胡萝卜素降解过程的关键基因及其功能和调控机制还未有报道，对于不同品种呈现不同香气类型的分子机理研究也较少。因此，了解烟草类胡萝卜素降解关键基因在类胡萝卜素降解及累积中的作用，对于调节类胡萝卜素代谢途径，调控类胡萝卜素及其降解产物的种类和含量，改良烟叶香气质量风格、降低烟草对人体健康的影响具有重要的现实意义。

对于其它模式植物类胡萝卜素降解关键基因的研究可以为研究烟草类胡萝卜素降解提供借鉴。已发现，类胡萝卜素裂解双氧合酶（carotenoid cleavage dioxygenases, CCDs）可催化裂解很多类胡萝卜素底物生成许多天然活性化合物（apocarotenoids），包括生长调节剂、色素、风味和芳香味物质、防御化合物等，是类胡萝卜素降解过程的关键酶[1,15]。CCD由一个古老的基因家族编码，在细菌、植物和动物中都存在CCD基因。在长期的进化过程中，CCD基因家族形成了几个显著的特性：比如都需要Fe2+催化；均包含 4 个保守的与Fe2+结合有关的组氨酸残基；C 端含有该基因家族保守的信号肽序列等[16-17]。模式植物拟南芥包含 9 种CCD基因，其它植物中的CCD均是根据与拟南芥的同源性进行命名。其中，有 5 种与ABA的合成有关，对植物的耐旱性起重要作用[18]，它们编码的酶偏好底物为9-顺式环氧类胡萝卜素(nine-cis-epoxycarotenoids), 堇菜黄素(violoxanthin)或者新叶黄素 (neoxanthin)，对底物的 11-12/11’-12’位双键具有特异性裂解作用，被单独命名为NCED (包括NCED2, 3, 5, 6, 9)，其余 4 个被命名为CCD (包括CCD1,4,7,8)。植物中，CCD催化的类胡萝卜素底物非常丰富，类胡萝卜素降解时因双键断裂部位不同，可产生不同碳原子数的化合物，进一步形成许多重要的香气物质。拟南芥CCD1 和CCD7可以裂解底物的9-10/9’-10’位双键，胭脂树BoLCD可裂解番茄红素的5-6/5’-6’位双键[19]，番红花CsZCD可裂解玉米黄质的7-8/7’-8’位双键[20]。进一步研究发现，不同的CCD基因功能各异。其中，CCD1基因催化类胡萝卜素类物质降解产生的醛类和酮类物质，比如β-环柠檬醛、β-紫罗兰酮、牻牛儿醛、香叶基丙酮以及 α-和 β-大马酮等，是植物中重要的香气物质来源，对于植物的生长发育、环境适应以及品质具有重要作用[15]。CCD4可以对称裂解类胡萝卜素类底物的9-10/9’-10’双键生成C13酮类物质。对菊花的研究发现，CCD4基因可以降解β-胡萝卜素生成β-紫罗兰酮，而且与白色花的形成有关[21]，但是苹果、木犀等植物的CCD4则没有此功能，而且不同植物甚至同一物种的CCD4的基因结构差异很大，可分为有无内含子两种类型[22-23]。拟南芥、矮牵牛和豌豆等植物的CCD7和CCD8则与抑制侧枝生长的独脚金内酯的合成有关[16,24-25]。对几个单子叶和双子叶植物的CCD7和CCD8所受的选择压力分析发现，CCD7和CCD8非常保守，没有检测到正选择作用存在[26]。

几种CCD基因中，CCD1基因的作用机制最为复杂。近来，拟南芥CCD1基因的同源物已经从葡萄、油桃、番茄、矮牵牛以及番红花等植物中得到分离[20,27-30]。在不同的植物中，CCD1编码的酶具有底物降解偏好性和功能特异性。对玉米的研究表明，CCD1 可以裂解类胡萝卜素的 9-10/9’-10’ 和 5-6/5’-6’位双键生成C13和C8酮类物质，这包括催化裂解ζ-胡萝卜素生成香叶基丙酮、番茄红素生成甲基庚烯酮、δ-胡萝卜素生成α-紫罗兰酮、β-胡萝卜素生成β-紫罗兰酮等[31]；而水稻CCD1可以裂解番茄红素的5-6/5’-6’位双键生成假性紫罗兰酮、甲基庚烯酮和牻牛儿醛等C10类物质[32]；番红花CCD1催化7-8/7’-8’位双键裂解玉米黄质生成3-羟基-β-紫罗兰酮[20]；拟南芥以及番茄CCD1主要偏好底物则为β-胡萝卜素。在黄金稻米胚乳中过表达CCD1基因发现CCD1以apocarotenoids为底物[33]。因此，应对不同植物的CCD1基因分别进行详细深入的研究才能逐步了解类胡萝卜素降解的共性机制。目前，NCBI数据库中除烟草Nicotiana langsdorffiix Nicotiana sanderae杂交种CCD1的部分序列外，还没有相关基因克隆的报道。我们已经得到烟草品种K326CCD1基因的全序列，功能研究正在进行中。

2 烟草类胡萝卜素代谢的调节

烟草类胡萝卜素代谢属于植物类异戊二烯合成代谢的一部分。类异戊二烯合成代谢是一个极其复杂而庞大的代谢系统，受到发育阶段和生长环境等诸多因素的影响。烟草中类胡萝卜素生物合成是在叶绿体中完成的，然而其合成酶类却是核基因编码的，并在胞质中翻译成酶的前体，最后通过转运系统进入叶绿体。因此，类胡萝卜素生物合成的调节在合成酶基因的表达、翻译、转运等阶段都可以进行。通过对类胡萝卜素生物合成和降解途径中上下游关键基因的调节，已经取得很多有意义的结果。比如烟草中过表达葡萄R2R3-MYB转录因子(VvMYB5b)会导致植株矮小、叶的形态改变，种子萌芽能力减弱，β-胡萝卜素量上调[34]。此外，高等植物的类胡萝卜素是光合作用天线系统和反应中心叶绿素结合蛋白的重要组成部分，因此环境因子对体内类胡萝卜素生物合成基因的表达也有明显的影响。研究表明，紫外线(UV-B)照射后，烟草叶片中的类胡萝卜素含量上升，其合成关键酶类的表达量显著提高[35]。另外发现，烟草体内过表达细菌脱氢酶基因crtZ可增加β-胡萝卜醇类化合物的含量，提高烟草对紫外线的耐受能力[36]。除此之外，一些抑制剂可以有效的抑制类胡萝卜素的生物合成[37]。

对植物类胡萝卜素降解的调节机制报道较少，有待更加深入的研究。干旱以及一些倍半萜类抑制剂也可以通过增加或抑制NCED的合成，进而调节ABA的生物合成[38-39]，而对其它几种CCD的调节却未见相关报道。

3 烟草类胡萝卜素基因工程研究进展

烟草是较为理想的模式作物，易于进行遗传转化和培养，是类胡萝卜素遗传研究及植物基因工程改良的常用材料。Busch等于2002年从烟草中克隆了PSY和PDS，并对其在类胡萝卜素代谢过程中的功能进行了研究。发现，过表达PSY-1 和PSY-2 会导致转基因植株矮化、叶形改变和色素积累发生改变，而反义表达PSY和PDS则出现致死表型[40]。Kumagai 等将番茄PSY基因正义导入野生本氏烟草，植株呈现亮橙色，叶片中积累八氢番茄红素，反义导入番茄PDS基因出现白色表型，同样积累大量八氢番茄红素[41]。Mann等将雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）的β-胡萝卜素酮化酶基因CrtO导入普通烟草超量表达，导致烟草花的蜜腺有色体中积累以超强抗氧化剂虾青素为主的酮类类胡萝卜素，蜜腺的颜色也由黄变红[42]。这一研究结果揭示了外源β-胡萝卜素酮酶能够与植物中的β-羟化酶一起产生虾青素等酮基类胡萝卜素，这为以后在其它植物中进行类似的操作提供了有益借鉴。

此外，类胡萝卜素是 ABA 生物合成的前体物质，ABA可以调节植物对于非生物逆境的适应能力。很多研究表明，在烟草中过表达黄龙胆（Gentiana Lutea）和笔花豆（Stylosanthes guianensis）的NCED可以延长种子萌发时间、在一定程度上降低气孔导度和蒸腾速率、提高内源ABA的含量、增加对强光和氧化胁迫的抗性进而提高烟草的耐旱和耐盐能力，但是转化不同外源NCED基因作用各异[43-44]。 除此之外，类胡萝卜素基因工程在烟草抗除草剂方面也有相关报道。Misawa等将细菌八氢番茄红素基因crtl正义导入烟草，β-胡萝卜素合成增强，同时对除草剂的抗性增强[45]。Wagner等将细菌八氢番茄红素脱氢酶基因PDS导入烟草，对除草剂nor flurazon和 fluridone的抗性分别增加了58倍和3倍[46]。这为从类胡萝卜素代谢途径的上下游进行基因工程操作改善植物的抗性提供了思路。

4 讨论与展望

综上所述，随着越来越多类胡萝卜素代谢途径中的主要基因和酶的分离和鉴定，利用基因工程手段提高类胡萝卜素在细胞中的生产率、调整类胡萝卜素的成分、改变生产类胡萝卜素的宿主等，都将逐步变成现实。将水仙的类胡萝卜素代谢基因PSY、LYCB和细菌的CrtI基因转入水稻胚乳，育成胚乳中积累了大量类胡萝卜素、米粒金黄的“黄金大米”[47]以及将欧氏杆菌CrtB转入油菜，育成油菜种子中类胡萝卜素含量比野生型增加了50倍，且主要为α-和β-胡萝卜素的“金色油菜”[48]的成功案例为开展烟草类胡萝卜素基因工程提供了有益思路。目前，类胡萝卜素的基因工程改良以提高β-胡萝卜素含量为主，随着人们对玉米黄质、虾青素等其它类胡萝卜素的营养功能和经济价值方面的认识，烟草作为一种生物反应器－叶绿体转基因植物[49-51]，必将在以后发挥其优势。

然而，相对于其它很多植物，目前对烟草类胡萝卜素代谢的调控机制以及代谢关键基因的表达调控了解有限，利用基因工程来调控其代谢带有一定的盲目性。而且通过基因工程改变类胡萝卜素代谢途径有可能会干扰其它萜类化合物如植物激素等的合成，引起代谢紊乱，从而影响植株的正常生长。类胡萝卜素是复杂的光合系统的重要组分，因此在今后的类胡萝卜素基因工程中要注意类胡萝卜素代谢中源和库的协调，对烟草香气、品质改良中应保持与其它来源致香成分的协调，才能最终利于烟草品质的提升。

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