多杀性巴氏杆菌外膜蛋白研究进展

裴志花，曲桂娟，马红霞，王 开

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春130118）

多杀性巴氏杆菌（Pm）是有荚膜的革兰阴性短杆菌，可感染多种动物并引起发病，如禽霍乱、猪萎缩性鼻炎、牛和水牛的出血性败血症、牛羊的地方流行性肺炎、兔鼻炎以及由于猫狗咬伤导致的人伤口脓肿和脑膜炎等。

根据Pm荚膜和脂多糖的不同，可将Pm分为A、B、D、E和F 5个血清群16个血清型。不同的血清群和血清型引起的疾病不同，如禽霍乱通常由A：1型和A：3型引起，出血性败血症主要由B：2型或E：5型引起，猪萎缩性鼻炎主要由产毒素的D型引起。Pm是很多哺乳动物体内普遍存在的条件性致病菌，本病的发生，源于宿主自身条件（物种、年龄、免疫水平）和细菌毒力因子（脂多糖、荚膜、黏附素、外膜蛋白等）相互作用的结果。

1 Pm外膜蛋白及其分类

1.1 Pm外膜蛋白 外膜蛋白（outer manbrance proteins，OMPs）是外膜中镶嵌的多种蛋白质的总称。这些蛋白位于Pm和宿主细胞的接触面上，其功能受到各种选择压力的影响，OMPs能从不同程度展示不同菌株间的变化，常用来评定菌株间的差异，从而确定与流行病学的关联［1］。Pm外膜蛋白作为一种选择性屏障，可以阻止多种有毒分子进入细菌细胞，这是细菌在多种环境下得以生存的根本保障。此外，外膜蛋白还有很多其他作用，如菌体细胞养分的吸收、运输分子进出菌体细胞、与宿主细胞的黏附等，在细菌对宿主的感染和致病过程中起着重要作用。

1.2 Pm外膜蛋白分类 Pm外膜蛋白的构成很复杂，根据外膜蛋白在细胞内的拷贝数不同，可分为主要蛋白和微量蛋白，主要蛋白在细胞内的拷贝数可达2×105左右，包括外膜蛋白H（OMPH）、外膜蛋白A（OMPA）、铁调节蛋白等。微量蛋白种类很多，在细胞内的拷贝数为103～104。根据外膜蛋白的功能不同可分为结构蛋白、转运蛋白、结合蛋白、黏附素、蛋白质组装器、膜相关酶等。根据外膜蛋白的结构特征不同可分为：小β－桶膜锚蛋白、非特异性孔蛋白、特异性通道蛋白、能量依赖性运输通道蛋白、蛋白质分泌孔蛋白、外膜引导蛋白、蛋白质造孔毒素等。另外，OMPs的数量及种类也因菌株和培养条件的不同而有所不同。

2 Pm外膜蛋白的主要功能群

2.1 结构蛋白 Pm具有代表性的结构蛋白主要包括即外膜蛋白A（OMPA）和肽聚糖相关脂蛋白两大类。

2.1.1 OMPA 蛋白 OMPA 蛋白属于小β－桶膜锚蛋白，连接着细菌外膜和肽聚糖。Pm OMPA在大肠杆菌细胞内表达的拷贝数可达到105，其表达严格受转录后水平控制。OMPA蛋白的主要功能包括：（1）细胞稳定剂的作用。OMPA蛋白通过它的C－末端与肽聚糖的相互作用来稳定细胞结构，并参与生物膜的生成。（2）免疫保护作用。OMPA蛋白具有较强的免疫保护作用，能诱导体液免疫和细胞免疫，能够辅助其他抗原内化和交叉提呈，具有潜在的免疫载体功能。免疫学分析显示，体内和体外表达的OMPA蛋白均有免疫原性［2］。（3）介导Pm对宿主细胞的黏附和侵袭作用。启动感染过程。另外，OMPA蛋白还是一种免疫靶标，参与免疫逃避。

2.1.2 肽聚糖相关脂蛋白 肽聚糖相关脂蛋白主要包括肽聚糖相关脂蛋白交叉反应蛋白（peptidoglycan－associated lipoprotein cross－reacting protein，PCP）和P6样蛋白两种。

Pm PCP是一种大小为15.6kDa的脂蛋白，与流感嗜血杆菌PCP具有80%的序列相似性，是血清杀菌活性的靶标。PCP与大肠杆菌及多食醋弧菌属的外膜脂蛋白SlyB蛋白具有相似性。Lo等采用体内表达技术将Pm PCP编码基因筛选出来，命名为Pm0554，经证实该蛋白在细菌感染过程中表达。用PCP重组疫苗及大肠杆菌系统表达、纯化的PCP蛋白免疫鸡和鼠，都不能诱导产生针对同源Pm攻击的保护力。P6样蛋白，因其编码基因与流感嗜血杆菌的P6外膜蛋白基因具有高度同源性而得名。研究发现，兔源Pm P6样蛋白具有抗原性，能诱导禽类产生高滴度抗体，但不能保护它们免受巴氏杆菌感染。P6样蛋白基因非常保守，杂交试验显示，16种血清型的Pm均存在该基因，可用于PCR检测和核酸杂交检测。2008年，肖国生等从猪源5：A型Pm Ts－8株中扩增出453bp的psl基因，与禽Pm T16株的psl基因序列只相差2个碱基，同源性高达99%，与流感嗜血杆菌编码P6蛋白的基因序列同源性为83%［3］。

2.2 转运蛋白 Pm转运蛋白主要包括外膜蛋白H（OMPH）和TolC蛋白。

2.2.1 OMPH蛋白 OMPH是Pm最主要的外膜蛋白之一，属于孔蛋白，是一种通道形成离子载体，其分子量为32－39ku。不同血清型的 Pm OMPH蛋白具有很高的同源性，其异源性主要源于318－333位上部分氨基酸的变异，而大部分的变异又集中在60－80aa和200－220aa两个不连续的超变区，这两部分分别与暴露在外表面的2个环形结构相对应。这些结构可能与宿主的免疫系统接触，并通过变异来逃避免疫监测。

Pm OMPH蛋白能诱导动物机体产生高水平的保护性抗体。Garrido等从A血清群中鉴定了2个OMPH（OMP1和OMP2），经验证这两个基因的基因组是连续的并且可以独立转录的。应用fur－OMPH1－OMPH2三重突变株提取的外膜蛋白免疫小鼠，可以保护全部小鼠免受异源强毒Pm感染。将OMP H全基因的N－末端与硫氧还蛋白（Trx）融合表达，可以诱导小鼠产生70%的保护力免受同源菌株的攻击［4］。郭东春等研究证实鸭Pm重组OMPH蛋白具有良好的免疫学活性［5］。孙颖将Pm OMPH基因重组质粒载入胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）菌影，免疫试验表明，App菌影装载pCDNA－OMP H的疫苗对猪App和Pm感染的保护率可达100%［6］。众多研究结果表明，Pm OMPH蛋白具有很好的免疫原性，使得开发Pm外膜蛋白疫苗成为可能。

2.2.2 TolC蛋白 Tolc蛋白是一个可以排出大分子、小分子、重金属等“异类”分子的孔道蛋白，是Ⅰ型分泌系统和射流泵的重要成分。TolC蛋白是由3个独立多肽亚基形成的三聚体孔蛋白，可以通过蛋白质构象的改变，形成一个连续管道将细菌胞浆和外部环境瞬间连通，同时将进入胞浆干扰蛋白质合成的药物等“异类”分子排出，使菌体内药物浓度下降，从而介导细菌耐药。Hatfaludi等鉴定出两个Pm TolC蛋白质、Pm0527和Pm1980。蛋白质分析显示，Pm0527和Pm1980与其他药物外排蛋白同属于一个TolC家族，任一基因发生突变都会导致Pm对多种化学药物的敏感性增加［7］。

2.3 结合蛋白 结合蛋白主要指铁调节外膜蛋白的各个成员，这类蛋白仅在限铁条件下表达。由于宿主体内转铁蛋白、乳铁蛋白、结合珠蛋白及血红蛋白等铁结合蛋白的存在，体内的游离铁浓度很低，绝大多数铁处于螯合状态。因此，细菌要想感染成功，必须进化成一系列的高亲合性的摄铁系统，与宿主竞争摄取铁离子复合物，从而获取铁满足自身代谢需要。目前已经确定出三类铁摄取系统，他们分别利用铁载体、转铁蛋白和血红蛋白受体，他们的吸收机制也各有不同。

2.3.1 铁载体受体 铁载体受体是由细菌细胞分泌的，其功能是从宿主铁结合糖蛋白上摄取铁。铁－铁载体复合物首先和细菌表面的特异性受体结合，在TonB系统供能的前提下，铁被运输到细菌细胞内供其利用。Choi－Kim等报道了3个分子量分别为76kDa，84kDa和96kDa的铁调节外膜蛋白，这3种蛋白只有Pm培养在无铁培养基中或在体内生长时才会表达，火鸡康复血清可以和这三种蛋白发生反应。

2.3.2 转铁蛋白、乳铁蛋白受体 铁吸收的第二种机制，是通过菌体表面的铁结合蛋白受体与宿主的铁结合蛋白直接作用来摄取铁。转铁蛋白和乳铁蛋白上铁的清除需要借助于其受体TbpB/TbpA的参与，并需要TonB系统提供能量，TbpB/TbpA是最主要的转铁蛋白、乳铁蛋白受体。研究显示，Pm有一个独特的TbpA受体，不需要第二受体蛋白TbpB的参与就能够有效的从牛转铁蛋白中获得铁。2005年，Shivachandra等从水牛（B：2）Pm菌株中扩增出TbpA基因，测序显示，该基因与A：1型Pm TbpA基因具有98%的相似性［8］。Ewers统计显示289株猪源和禽源Pm中，均未扩增出TbpA基因。只在牛源、羊源和水牛源的（57.1%）Pm菌株中分离到 TbpA 基因［9］。

2.3.3 血红蛋白受体 目前，已知的Pm血红蛋白受体有HgbA蛋白、HgbB蛋白、多重血红蛋白绑定蛋白、HasR蛋白、TonB络合物等。HasR蛋白是血色素摄取系统特有的外膜蛋白受体，Prado等从A：3株Pm中鉴定出一个96kD的HasR蛋白，具有很高的免疫原性［10］。TonB络合物包含 TonB、ExbB和ExbD三种蛋白，铁主动转运的动力需要TonB络合物来提供。其中TonB蛋白是一种能量传递器，负责受体在转铁蛋白附近的定位，从而促进铁或含铁分子与其相应受体的结合，而ExbB和ExbD负责铁转运后TonB蛋白的稳定和回收。EbB、EbD和TonB基因的表达水平受铁调控，都是Pm感染的必需基因，任何一个基因突变或失活都会导致Pm毒力发生改变［11］。

2.4 黏附素 细菌对宿主细胞或细胞外基质蛋白的黏附是细菌进一步在动物体内生长繁殖、引起病理变化的前提条件，是致病的第一步。通常介导细菌黏附作用的黏附素也是潜在的致病因子。很多细菌可以产生黏附素，如流感嗜血杆菌的Hap、Hia/Hsf、HMW1/2、血凝素及菌毛等，致病性大肠杆菌的外膜蛋白OMPX等。

2.4.1 4型菌毛 4型菌毛是Pm的主要黏附素，它能使细菌牢固地黏附于皮肤、呼吸道、消化道、泌尿生殖道的黏膜上皮细胞上。2007年，Siju等克隆到B：2型Pm ptfA基因，测序结果显示，B：2型Pm ptfA基因与液相色谱法获得的A：1型ptfA菌毛亚单位蛋白编码核苷酸的相似性为78.4%，而且前200个核酸序列是完全相同的。利用ptfA重组蛋白兔抗血清，在B：2型、A：1型Pm裂解液中均能检测到18kD的蛋白质，说明这几种细菌中均存在4型菌毛［12］。

2.4.2 纤维结合素受体 纤维结合素是一种大分子糖蛋白，分子上有许多细菌结合位点，很多细菌都存在纤维结合素受体，通过其脂质末端与纤维结合素相结合，但结合部位不同。Mullen等通过对Pm DNA噬菌体库的筛选，获得分子量为12.7kDa的ComE1蛋白。ComE1是一种公认的纤维结合素受体，重组表达的ComE1主要以GST融合蛋白的形式与可溶的和固态的纤维结合素相结合。透射电镜技术显示，ComE1位于Pm的细菌表面，ComE1抗血清可以阻断多杀性巴氏杆菌与纤维结合素的结合［13］。

2.4.3 丝状血凝素 细菌的血凝素在细菌的黏附过程中起重要作用，如鼠伤寒杆菌的甘露糖抗性血凝素、百日咳杆菌的丝状血凝素（FHA）等。Tatum等通过对Pm70基因组序列进行分析，找到2个丝状血凝素基因，FhaB1和FhaB2，两基因编码的蛋白质具有45%的序列相似性。将禽A：3型Pm的FhaB2基因突变后，对火鸡进行攻毒，其毒力明显减弱。将FhaB2血凝素N－末端的三个基因片段联合表达可诱发火鸡产生保护性免疫反应［14］。

2.5 膜相关酶 Boyce等通过分析体外培养的Pm外膜成分，获得Pm磷脂酶Pm1426，其功能是水解细菌外膜表面的磷脂。重组Pm1426不能诱导鸡产生针对同源细菌的保护力［15］。Pm另一具代表性的膜相关酶是唾液酸苷酶，其主要功能是摄取与糖蛋白、糖脂等相结合的唾液酸，来形成自身成分，进而逃避宿主免疫系统的识别。已证实唾液酸苷酶与致病菌的毒力有关，尤其是那些主要侵害或栖息于黏膜表面的细菌。唾液酸苷酶可协助Pm在宿主黏膜细胞定植，某些基因的缺失可导致Pm毒力的减弱和侵袭力的降低［16］。

2.6 其他蛋白 除了上述常见的功能蛋白质外，多杀性巴氏杆菌外膜蛋白还包括蛋白质组装器、交叉性保护抗原PlpE蛋白等。PlpE重组蛋白是目前发现的第一个可以刺激机体产生针对不同血清型Pm高水平保护性免疫反应的抗原［17］。

近年来人们对Pm外膜蛋白的研究虽然取得了一定进展，但对外膜蛋白详细认知还远远不够，Pm外膜蛋白的组成、结构和功能是相当复杂的。因此，要详细了解多杀性巴氏杆菌外膜蛋白的全部组成，以及每一个蛋白质的具体功能，还需要我们不断地进行努力和探索。

［1］ Hatfaludi T，Al－hasani K，Boyce J D，etal.Outer membrane proteins ofPasteurellamultocida［J］.Vet Microbial，2010，144（1）：1－17.

［2］ 孙䶮，郭东春，刘家森，等.鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A基因的表达及抗原性鉴定［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2010，22（2）：52－55.

［3］ 肖国生，曹三杰，黄小波，等.猪多杀性巴氏杆菌5：A型Ts－8株psl基因的克隆和序列分析［J］.河南农业科学，2008，4：108－114.

［4］ Garrido M E，Bosch M，Bigas A，etal.Heterologous protective immunization elicited in mice byPasteurellamultocidafur OmpH［J］.Int Microbiol，2008，11（1）：17－24.

［5］ 郭东春，孙䶮，刘家森，等.鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的表达及抗原性鉴定［J］.中国预防兽医学报，2010，32（7）：574－576.

［6］ 孙颖.App菌影装载多杀性巴氏杆菌OmpH外膜蛋白DNA疫苗的研究［D］.天津：天津农学院，2011.

［7］ Hatfaludi T，Al－hasani K，Dunstone M，etal.Characterization of TolC efflux pump proteins from Pasteurella multocida［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（11）：4166－4171.

［8］ Shivachandra S B，Kumar A A，Amaranath J，etal.Cloning and characterization of tbpA gene encoding transferrin－binding protein （TbpA）fromPasteurellamultocidaserogroup B：2（strain P52）［J］.Vet Res Commun，2005，29（6）：537－542.

［9］ Ewers C，Lubke－becker A，Bethe A，etal.Virulence genotype ofPasteurellamultocidastrains isolated from different hosts with various disease status［J］.Vet Microbiol，2006，114（3－4）：304－317.

［10］Krieg S，Huche F，DiederichsI K，etal.Heme uptake across the outer membrane as revealed by crystal structures of the receptor－hemophore complex［J］.Proc Natl Acad Sci，2009，106（4）：1045－1050.

［11］Krewulak K D，Vogel H J.Structural biology of bacterial iron uptake［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1778（9）：1781－1804.

［12］Siju J，Kumar A A，Shivachandra S B，etal.Cloning and characterization of type 4fimbrial gene（ptfA）ofPasteurellamultocidaserogroup B：2 （strain P52）［J］.Vet Res Commun，2007，31（4）：397－404.

［13］Mullen L M，Nair S P，Ward J M，etal.Novel adhesin fromPasteurellamultocidathat binds to the integrin－binding fibronectin FnIII9－10repeats［J］.Infect Immun，2008，76（3）：1093－1104.

［14］Tatum F M，Tabatabal L B，Briggs R E.Protection against fowl cholera conferred by vaccination with recombinantPasteurellamultocidafilamentous hemagglutinin peptides［J］.Avian Dis，2009，53（2）：169－174.

［15］Boyce J D，Cullen P A，Nguyen V，etal.Analysis of thePasteurellamultocidaouter membrane sub－proteome and its response to the in vivo environment of the natural host［J］.Proteomics，2006，6（3）：870－880.

［16］Tatum F M，Tabatabal L B，Briggs R E.Sialic acid uptake is necessary for virulence ofPasteurellamultocidain turkeys［J］.Microb Pathog，2009，46（6）：337－344.

［17］Wu J R，Shien J H，S hieh H K，etal.Protective immunity conferred by recombinantPasteurellamultocidalipoprotein E（PlpE）［J］.Vaccine，2007，25（21）：4140－4148.